GC-MS/MS在研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

虞俊超， 陳翠紅， 徐利斯， 馬小東， 孟鳳林， 展思輝

(南開大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300351)

0 引 言

研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高校研究生培養(yǎng)的重要組成部分，是提高研究生科研水平和創(chuàng)新能力的中心環(huán)節(jié)[1-2]。在環(huán)境分析領(lǐng)域，熟練掌握相關(guān)儀器分析技術(shù)與方法對(duì)研究生進(jìn)行科學(xué)研究及日后從事相關(guān)工作至關(guān)重要。雖然目前國內(nèi)多數(shù)高等院校已開設(shè)了研究生的儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)課，但受實(shí)驗(yàn)條件限制，課程普遍與本科實(shí)驗(yàn)相近，實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容拓展不足，這不利于研究生的高質(zhì)量培養(yǎng)[3]。

氣質(zhì)聯(lián)用儀因其兼有氣相色譜的單一流動(dòng)相(通常為He)供應(yīng)優(yōu)勢(shì)、高效色譜分離能力及質(zhì)譜對(duì)未知物的強(qiáng)大定性/定量功能而被廣泛應(yīng)用于熱穩(wěn)定性較好的中小分子化合物分析。由于其較寬廣的使用范圍，氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)試已成為化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、環(huán)境工程等專業(yè)儀器分析課程的常見實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。國內(nèi)關(guān)于氣質(zhì)聯(lián)用實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐探索很多，但多是面向本科生且使用氣相色譜-單級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)[4-8]。然而在實(shí)際的環(huán)境檢測(cè)中，單級(jí)質(zhì)譜(MS)常受到復(fù)雜環(huán)境樣品的基質(zhì)干擾，有時(shí)無法滿足目標(biāo)物的確證分析需求。相比于單級(jí)質(zhì)譜，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行二次裂解，有效地提高了測(cè)試的選擇性和靈敏度，因此在環(huán)境分析中發(fā)揮著愈發(fā)重要的作用[9]。

近幾年，在國家“統(tǒng)籌推進(jìn)世界一流大學(xué)和一流學(xué)科建設(shè)”計(jì)劃支持下，我校環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院陸續(xù)購置了一批高精尖儀器，集中于大型儀器平臺(tái)共享使用，這對(duì)學(xué)院教學(xué)及科研發(fā)展形成了強(qiáng)有力的支撐。一流的研究生教育是高校實(shí)現(xiàn)“雙一流”建設(shè)目標(biāo)的基石[10]。為進(jìn)一步提高研究生的科研實(shí)踐能力，學(xué)院儀器平臺(tái)依托其較優(yōu)越的設(shè)備條件和專職教師豐富的分析測(cè)試經(jīng)驗(yàn)，以必修課的形式開設(shè)了一系列的現(xiàn)代儀器分析課程(70學(xué)時(shí))。本文涉及的“氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS/MS)測(cè)定土壤中的硝基苯”就是其中的一節(jié)實(shí)驗(yàn)課，課程緊系環(huán)境專業(yè)特色，并基于GC-MS/MS多樣的定性/定量功能拓寬儀器分析實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，同時(shí)積極進(jìn)行多元化教學(xué)方法實(shí)踐，對(duì)研究生的氣質(zhì)聯(lián)用實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行探索。

1 GC-MS/MS實(shí)驗(yàn)教學(xué)選題情況簡(jiǎn)述

實(shí)驗(yàn)課面向研究生，考慮到他們將來科研工作中可能遇到更復(fù)雜多樣的氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)試需求，因此選用GC-MS/MS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)。如圖1所示，GC-MS/MS主要由5部分組成，分別為氣相色譜、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器及數(shù)據(jù)系統(tǒng)。進(jìn)樣后樣品各組分先通過氣相色譜進(jìn)行高效分離，然后依次進(jìn)入離子源完成離子化(形成帶電離子)，質(zhì)量分析器按離子質(zhì)荷比(m/z)實(shí)現(xiàn)分離分析，檢測(cè)器將樣品中不同組分的存在情況轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最后通過數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的匯總及處理。平臺(tái)購置的氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備采用大氣壓化學(xué)電離源(APCI)進(jìn)行測(cè)試，因其優(yōu)異的靈敏度和選擇性，該軟電離技術(shù)已被大量應(yīng)用于GC-MS(/MS)分析測(cè)試中[11]。

圖1 GC-MS/MS結(jié)構(gòu)解析

與單四級(jí)桿質(zhì)譜(MS)不同，三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)由一級(jí)四級(jí)桿(MS1)，線性加速碰撞室及三級(jí)四級(jí)桿(MS2)3部分(見圖1)構(gòu)成。樣品離子先進(jìn)入MS1篩選出目標(biāo)物的特征母離子；母離子與氣體(Ar)碰撞，裂解產(chǎn)生子離子；再由MS2捕集子離子。GC-MS/MS的結(jié)構(gòu)特性使其可提供更多分析模式：質(zhì)譜全掃描模式(MS scan)和子離子掃描模式(Product ion scan)可分別用于樣品組分的母離子和子離子電離特征分析，選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)可分別選擇目標(biāo)物的特征母離子、母離子-子離子對(duì)進(jìn)行定量分析。

硝基苯(Nitrobenzene)是一種芳烴類化合物，在農(nóng)藥、紡織、炸藥等工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)活動(dòng)中應(yīng)用廣泛[12]。早在1989年，硝基苯就被國家環(huán)保局列入“水中優(yōu)先控制污染物黑名單”。2016年，為切實(shí)加強(qiáng)土壤污染防治工作，國務(wù)院印發(fā)土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃，公布的污染物檢測(cè)名單也包括硝基苯。土壤中硝基苯類污染物定量分析常選用氣質(zhì)聯(lián)用儀(EI源)[13]，但目前尚無基于APCI源離子化的GC-MS(/MS)分析報(bào)道。依托學(xué)院大型儀器平臺(tái)的設(shè)備條件，設(shè)計(jì)了GC-APCI-MS/MS測(cè)定土壤基質(zhì)中硝基苯的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程，將科研項(xiàng)目轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)課程，豐富了實(shí)驗(yàn)的可探索性，有利于激發(fā)研究生的專業(yè)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)科研創(chuàng)新思維。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)的設(shè)定

(1) 通過教學(xué)，開拓學(xué)生的知識(shí)面，了解GC-MS/MS的結(jié)構(gòu)與工作原理。

(2) 通過實(shí)驗(yàn)，掌握GC-MS(/MS)的主要操作方法，加深學(xué)生對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用儀開展環(huán)境分析測(cè)試的認(rèn)識(shí)。

(3) 通過文獻(xiàn)調(diào)研，讓學(xué)生結(jié)合各自未來的研究方向，了解氣質(zhì)聯(lián)用分析測(cè)試的適用范圍，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的主動(dòng)學(xué)習(xí)興趣，為將來的科研工作做準(zhǔn)備。

3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與流程設(shè)計(jì)

3.1 試劑與材料

丙酮、正己烷、乙酸乙酯(色譜級(jí))及無水硫酸鈉(分析級(jí))購自天津市化學(xué)試劑六廠。硝基苯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 g/L。弗羅里硅土SPE柱(500 mg/3 mL)購于東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司。無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中300 ℃烘烤2 h，冷卻后放入試劑瓶備用。

天亮后，先后有兩個(gè)人扒著木排求救。男人沒有再阻攔，任表姐把他們一個(gè)一個(gè)拉上木排。第二個(gè)上岸的人見表姐沒穿衣服，身子抖得厲害，就脫下自己的衣服，擰干，讓表姐穿上。那是件中山裝，厚厚的卡其布料，外掛四個(gè)兜。應(yīng)該是干部裝，不知道是水里撈的還是那男人自己的。楊小水穿在身上又胖又長(zhǎng)，連下身也罩得嚴(yán)嚴(yán)實(shí)實(shí)的。

3.2 儀器分析條件

Agilent 7890B-Waters Xevo TQS型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。

(1) 氣相色譜條件。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。選用DB5-MS UI柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，升溫程序：起始溫度40 ℃，保持4 min，以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min。運(yùn)行時(shí)間18 min，溶劑延遲為6 min，傳輸線溫度280 ℃。

(2) 質(zhì)譜條件。采用大氣壓氣相色譜技術(shù)(APGC)，APCI電離源，正離子化模式，電暈針電壓2.0 μA，離子源溫度：150 ℃，MS scan掃描范圍：20～300 m/z，Product ion scan 掃描范圍：20～200 m/z。

3.3 土壤樣品制備

樣品前處理是完成待分析物提取、凈化和富集的重要過程，對(duì)后續(xù)的分析測(cè)試效果影響顯著[14]。考慮到土壤樣品處理過程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)過長(zhǎng)，課程采用教學(xué)演示的方式對(duì)樣品前處理各步驟用途、質(zhì)量控制等方面進(jìn)行詳細(xì)講解，具體制備流程如下：稱取約10.0 g樣品放入燒杯中，以20 mL丙酮-正己烷(1∶1, V/V)超聲提取30 min，提取結(jié)束后使用離心機(jī)3 000 r/min離心5 min(提取流程重復(fù)3次)，合并有機(jī)提取液；提取液經(jīng)無水硫酸鈉柱除水后，使用弗羅里硅土柱凈化樣品：依次用10 mL正己烷、10 mL乙酸乙酯淋洗柱子，土壤提取液裝載后，選用12 mL乙酸乙酯洗脫；將洗脫液氮吹至近干，使用正己烷定容至1 mL，待上機(jī)測(cè)試。

3.4 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。以小組的形式(每組3～5人)開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)，保證學(xué)生都能進(jìn)行儀器操作。設(shè)計(jì)了兩套實(shí)驗(yàn)方案，通過抽簽分配儀器分析實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，引導(dǎo)不同組別的學(xué)生協(xié)作完成單級(jí)質(zhì)譜的SIM和串聯(lián)質(zhì)譜MRM方法開發(fā)，并將兩套方法對(duì)土壤基質(zhì)樣品的測(cè)試效果進(jìn)行比較，讓學(xué)生對(duì)GC-MS(/MS)的主要定性/定量功能有較全面的了解。

圖2 GC-MS(/MS)實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)

4 多元化教學(xué)方法探索

研究生是儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中的學(xué)習(xí)主體，教師須改變以往“灌輸式”的教學(xué)培養(yǎng)方式，增強(qiáng)教學(xué)的直觀性、互動(dòng)性、探索性，建立以學(xué)生為中心，教師為引導(dǎo)的新型教學(xué)關(guān)系[15-16]。為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率，達(dá)到鞏固研究生專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí)，提高科研創(chuàng)新能力的目標(biāo)，課程從4個(gè)方面進(jìn)行多元化的教學(xué)方法探索(見圖3)。

圖3 多元化的大型儀器分析教學(xué)方法實(shí)踐

(1) 健全課前預(yù)習(xí)制度。強(qiáng)化學(xué)生課前預(yù)習(xí)。通過文獻(xiàn)資料調(diào)研，讓學(xué)生對(duì)硝基苯這類污染物的檢測(cè)意義，儀器分析方法有所認(rèn)識(shí)，以此鍛煉學(xué)生的主動(dòng)學(xué)習(xí)能力；開課前安排5 min，讓學(xué)生重溫實(shí)驗(yàn)講義，使學(xué)生對(duì)教學(xué)內(nèi)容與方式，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備流程、操作方法及相關(guān)注意事項(xiàng)有所了解，這有助于學(xué)生盡快進(jìn)入課堂學(xué)習(xí)狀態(tài)，提高學(xué)習(xí)效率。

(3) 開展基于問題的課堂回顧與討論。要求學(xué)生在教學(xué)完成后積極提問，設(shè)置課堂回顧與討論環(huán)節(jié)，并將此環(huán)節(jié)表現(xiàn)納入成績(jī)考核。通過課堂知識(shí)點(diǎn)回顧，深化學(xué)生對(duì)相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的理解；提出問題本身就是一種更主動(dòng)的學(xué)習(xí)過程，通過對(duì)問題的交流與討論，可以有效強(qiáng)化同組學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、方法的理解，也提高了學(xué)生們對(duì)儀器分析的探索興趣和創(chuàng)造能力。

(4) 課后開放性問題拓展。針對(duì)本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，設(shè)置開放性問題，讓學(xué)生結(jié)合自己的研究方向，進(jìn)行相關(guān)資料的再檢索。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行開放性探索，有助于穩(wěn)固學(xué)生知識(shí)積淀，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

5.1 氣相色譜條件選擇

在課前文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上[12]，讓學(xué)生對(duì)氣相色譜儀主要參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為250 ℃，確保硝基苯能以氣態(tài)的形式進(jìn)入色譜柱。實(shí)驗(yàn)選用DB5-MS UI非極性毛細(xì)管柱，設(shè)置梯度升溫程序?qū)⑾趸脚c樣品雜質(zhì)進(jìn)行高效分離。選擇正己烷作為溶劑，制備標(biāo)樣和土壤基質(zhì)樣品，在GC分析6 min后啟動(dòng)質(zhì)譜，切除溶劑峰，減少溶劑對(duì)GC-MS/MS分析測(cè)試的干擾。通過標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖確定硝基苯的保留時(shí)間為10.2 min。

5.2 質(zhì)譜掃描條件優(yōu)化

相比于單級(jí)質(zhì)譜(MS)，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可以提供更多樣的掃描模式。在GC-MS/MS實(shí)驗(yàn)過程中，可以先使用質(zhì)譜全掃描(MS Scan)了解硝基苯的APCI源電離行為，篩選出豐度較高的母離子，再采用子離子掃描模式(Product ion scan)觀察特征母離子的裂解特征，結(jié)合兩級(jí)質(zhì)譜的掃描信息有助于推斷待分析物的分子離子結(jié)構(gòu)。錐孔電壓、碰撞能量分別是MS Scan、Product ion scan模式中的重要調(diào)控參數(shù)，通過參數(shù)條件的梯度實(shí)驗(yàn)操作，使學(xué)生直接觀察到參數(shù)值的更改對(duì)儀器響應(yīng)的影響，既培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴季S，也加深了他們對(duì)GC-MS/MS結(jié)構(gòu)及測(cè)試原理的理解。硝基苯標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS掃描結(jié)果見圖4，在APCI源離子化條件下，最優(yōu)錐孔電壓為25 V，全掃描譜圖中最強(qiáng)峰是m/z 123.9，根據(jù)質(zhì)荷比推斷應(yīng)該是硝基苯(C6H5NO2)的質(zhì)子化離子[M+H]+，其余特征母離子主要為m/z 94.1、77.2及105.0。譜圖里的m/z 148.7可能來源于氣相系統(tǒng)中的酞酸酯類化合物干擾，該現(xiàn)象在其他氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)試中也有報(bào)道[17]。選擇高豐度的母離子m/z 123.9，通過設(shè)置不同碰撞能量(10～30 eV)進(jìn)行子離子掃描，記錄產(chǎn)物離子m/z 77.0、93.8、51.0、66.1的最優(yōu)碰撞能量參數(shù)。

通過質(zhì)譜掃描條件優(yōu)化，對(duì)硝基苯化合物建立了基于單級(jí)質(zhì)譜的SIM定量方法，以及基于串聯(lián)質(zhì)譜的MRM定量方法，具體參數(shù)見表1。

5.3 土壤基質(zhì)樣品測(cè)試效果

采用外標(biāo)法定量: 配制20、50、200、500、1 000 ng/mL硝基苯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)化合物的濃度值為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立5點(diǎn)校準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示在0～1 000 ng/mL范圍內(nèi)測(cè)試線性效果良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.994 0。使用GC-MS/MS方法對(duì)土壤樣品中的硝基苯含量進(jìn)行測(cè)定，未有檢出。通過對(duì)土壤基質(zhì)加標(biāo)樣品(800 ng/mL)進(jìn)行測(cè)定，全面比較SIM與MRM兩種定量方法對(duì)真實(shí)環(huán)境樣品的測(cè)試效果差別，不同方法的提取離子色譜分析效果如圖5。分析結(jié)果表明，與SIM方法相比，串聯(lián)質(zhì)譜MRM方法選用母-子離子對(duì)進(jìn)行分析測(cè)試，能明顯降低土壤基質(zhì)干擾，并增強(qiáng)色譜峰的信噪比值，顯著提高儀器分析測(cè)試的靈敏度。通過比對(duì)實(shí)驗(yàn)，學(xué)生對(duì)GC-MS(/MS)的環(huán)境分析測(cè)試效果有了更直觀的認(rèn)識(shí)，這有益于他們?nèi)蘸罂蒲泄ぷ鞯拈_展。

圖4 硝基苯的質(zhì)譜掃描條件優(yōu)化

表1 基于MS(/MS)的硝基苯定量和定性離子選擇

圖5 GC-MS(/MS)對(duì)土壤加標(biāo)樣品的測(cè)定效果比對(duì)

6 結(jié) 語

為提高學(xué)生的分析操作、創(chuàng)新及團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力，將大型儀器氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀引入到研究生的儀器分析實(shí)驗(yàn)課程中，選題為“GC-MS/MS測(cè)定土壤中的硝基苯”。課程緊系環(huán)境專業(yè)特色，并基于新設(shè)備多樣的測(cè)試功能，設(shè)計(jì)兩套氣質(zhì)聯(lián)用定性/定量思路，引導(dǎo)學(xué)生協(xié)作式開展儀器分析實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生對(duì)GC-MS(/MS)的主要分析測(cè)定功能有較全面的了解。同時(shí)為切實(shí)提高教學(xué)效果，從健全課前預(yù)習(xí)制度、貫徹對(duì)比性教學(xué)、開展基于問題的課堂回顧與討論、課后開放性問題拓展4個(gè)方面進(jìn)行多元化教學(xué)方法實(shí)踐。該實(shí)驗(yàn)課開設(shè)已歷時(shí)2年，對(duì)研究生科研實(shí)踐能力的培養(yǎng)助力明顯，教學(xué)效果良好。依托儀器平臺(tái)的先進(jìn)設(shè)備開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)，課程本身也可看作是環(huán)境專業(yè)研究生的“公用儀器操作準(zhǔn)入培訓(xùn)”，這為后續(xù)的公用實(shí)驗(yàn)室大型儀器開放，學(xué)生自主操作儀器開展科研工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。