基于UHPLC-Q-TOF-MS的三白草化學成分分析

江潔怡，胥愛麗，李養學，段福先，曾志浩，孫冬梅

(1.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095； 2.廣州中醫藥大學附屬廣東第二中醫院，廣東 廣州 510405)

三白草為三白草科三白草屬植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill. 的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫的功效，臨床上主要用于水腫、小便不利、淋瀝澀痛、帶下等癥；外用可治療瘡瘍腫毒、皮膚濕疹[1]。據報道，三白草中含有揮發油[2]、黃酮[3]、木脂素[4-5]、生物堿[6]、鞣質[7]等成分，其中木脂素、黃酮是其主要活性成分[8]，左月明[5]等從三白草中分離鑒定得到13個化合物，分別為三白脂、三白脂酮 A、1′-表-三白脂酮、里卡靈 B、里卡靈 A、5-甲氧基-里卡靈 A、三白脂素、5,5′-二甲氧基-三白脂素、nectandrin B、5,5′-dimethoxy-nectandrin B、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5,5′-tetramethoxy-7,7′-epoxylignan、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5-trimethoxy-7,7′-epoxylignan、machilin D 。曲瑋[9]等從三白草中分離得到7個化合物：meio-carpin、三白草內酰胺、馬兜鈴內酰胺AⅡ、4,5-dioxodehydroasimilobine、金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷。

本課題組前期已建立了同時測定三白草中多個木脂素類、黃酮類成分質量分數的方法[10-11]，為了進一步對三白草的化學組成進行整體把握，本研究擬采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間高分辨質譜聯用技術(UHPLC-Q-TOF-MS)對其化學成分進行分析檢測。UHPLC-Q-TOF-MS技術作為一種新型分析術，結合了UHPLC的高速、高分離性能和 TOF-MS的高分辨、高靈敏的定性能力以及強大的結構表征能力，可實現天然藥物中復雜龐大化合物體系的快速高效鑒定[12-14]。本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS法對三白草的化學成分進行分析檢測，初步鑒定出了15個具有紫外吸收的化合物，為三白草質量控制和藥效物質基礎研究提供實驗依據。

1 材料與儀器

Exion LC 20AD超高效快速液相色譜儀，X500R QTOF高分辨質譜系統，SCIEX OS 1.0 Software軟件，Peakview 1.2數據處理軟件(美國 AB Sciex公司)；XS205 DU電子分析天平(美國Mettler-Toledo公司)； Micro 17R微量離心機(美國Thermo公司)；KQ-700DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10自動純水機(美國MilliPore公司)。

三白草購自廣州清平藥材市場，經廣東省中醫藥工程技術研究院劉法錦教授鑒定為三白草科三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。甲醇、乙酸銨和甲酸等液相用試劑為質譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 色譜條件

Waters XSelected T3色譜柱 (150 mm×2.1 mm,2.5 μm) ；流動相：含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶甲醇(體積比0.05∶99.95)為流動相A ，含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶水(體積比0.05∶99.95)為流動相B，梯度洗脫(0～9 min，14%A→39%A；9～15 min，39%A→40%A；15～17 min，40%A→52%A；17～36 min，52%A→80%A；36～39 min，80%A→95%A；39～42 min，95%A；42～42.1 min，95%A→14%A；42.1～45 min，14%A)；柱溫：35 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣體積：2 μL；檢測波長：238 nm。

2.2 質譜條件

ESI離子源，正離子掃描模式；質量掃描范圍m/z100～1 500；氣簾氣壓力0.21 MPa，霧化氣壓力0.34 MPa，輔助氣壓力0.34 MPa，毛細管電壓5.5 kV，離子源溫度400 ℃，去簇電壓80 V，碰撞電壓(40±20)V。

2.3 供試品溶液的制備

取三白草粉末(過4號篩)約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%(體積分數，下同)甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，搖勻，于13 000 r/min下離心10 min，取上清液，即得。

3 結果

3.1 UHPLC-Q-TOF-MS成分鑒定

按照擬定的條件進行分析，得到三白草樣品的紫外吸收色譜圖及正離子模式下的總離子流圖，見圖1。從總離子流圖上得到各色譜峰的精確化合物分子量信息，并根據相對分子質量與理論精確相對分子質量的偏差小于百萬分之五內計算其精確分子式。運用Peakview數據處理軟件，與建立的三白草已知化學成分數據庫、ChemSpider 等數據庫進行匹配，根據各化合物的一級、二級質譜，同位素分布及化合物裂解規律做對比推測。結合文獻數據、數據庫檢索結果，共鑒定了三白草中15種具有紫外吸收的化學成分，見表1。

t/min3002001000-100150010005000mAU051015202530354045BAAU123456789101112131415

A. 正離子模式； B. 紫外吸收。

圖1三白草樣品總離子流圖
Figure1Total ion chromatograms of Saururi Herba

3.2 色譜峰的質譜裂解規律

通過數據庫匹配，并結合文獻數據，共鑒定了三白草中15種化學成分：綠原酸[15]、1-(7H-purin-6-yl)-4-piperidine carboxamide[16]、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷[17]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷[18]、金絲桃苷[18-19]、蘆丁[18-19]、槲皮素-3-鼠李糖苷-7-葡萄糖苷[18]、槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷)[18-19]、紅楠素 D[19]、Gelomulide N[20]、三白草酮[19]、(-)-二氫愈創木脂酸[19,22-23]、里卡靈 A[19,24]、12-phenyldodecanoic acid[21]、馬納薩亭 B[19]、5-(2,5-dimethyl-benzyloxy)-2-methyl-benzofuran-3-carboxylic acid methyl ester[19]。以綠原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、(-)-二氫愈創木脂酸、里卡靈 A的鑒定過程為代表進行詳細分析如下。

綠原酸：正離子模式下，得到分子離子峰355.101 4 [M+H]+，通過軟件計算得到分子式為C16H18O9。二級質譜產生的碎片離子m/z163.0386可能是母離子水解失去奎寧酸后的咖啡酸碎片離子峰，另有碎片離子m/z135.043 6 [M+H-C7H11O6-CO]+，如圖2所示。符合咖啡奎尼酸類化合物裂解途徑，結合文獻[14]，推斷峰1為綠原酸。

槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷：正離子模式下，得到分子離子峰479.082 1 [M+H]+，通過軟件計算得到分子式為C21H18O13。二級質譜產生碎片離子m/z303.049 8可能是母離子水解失去葡萄糖醛酸后的槲皮素苷元碎片離子峰，另有碎片離子m/z285.041 9[M+H-C6H8O6-H2O]+，m/z257.044 8 [M+H-C6H8O6-H2O-CO]+，m/z229.049 2 [M+H-C6H8O6-H2O-CO-CO]+，如圖3所示。符合黃酮苷類化合物裂解途徑，結合文獻[16]，推斷峰3為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。

表1 三白草的 UHPLC- Q-TOF-MS 鑒定結果Table 1 Chemical constituents of Saururi Herba by UHPLC-Q-TOF-MS

圖2 綠原酸的裂解途徑Figure 2 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

圖3槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的裂解途徑
Figure3Fragmentation pathway of quercetin 3-O-β-D-glucuronide

(-)-二氫愈創木脂酸：正離子模式下，得到分子離子峰331.190 1 [M+H]+，通過軟件計算得到分子式為C20H26O4。二級質譜產生碎片離子m/z207.137 9 [M+H-C20H17O2]+，m/z137.059 2 [M+H-C7H7O2]+，如圖4所示。符合木脂素類化合物裂解途徑，結合文獻[21-22]，推斷峰11為(-)-二氫愈創木脂酸。

里卡靈 A：正離子模式下，得到分子離子峰327.158 8 [M+H]+，通過軟件計算得到分子式為C20H22O4。二級質譜產生碎片離子m/z203.105 7 [M+H-C7H7O2]+，m/z188.082 6 [M+H- C7H7O2-CH3]+，m/z173.059 7 [M+H-C7H7O2-CH2O]+，m/z145.064 6 [M+H-C7H7O2-CH2O-CO]+，m/z137.059 4 [M+H-C12H13O2]+，如圖5所示。結合文獻[23]，推斷峰12為里卡靈 A。

圖4(-)-二氫愈創木脂酸的裂解途徑

Figure4Fragmentation pathway of (-)-dihydroguaiaretic acid

圖5里卡靈 A的裂解途徑
Figure5Fragmentation pathway of licarin A

4 討論

實驗考察了純甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水為提取溶劑時對三白草中成分的提取效果的影響，結果當甲醇體積分數低于50%時，木脂素類成分的提取效率較低，而當用純甲醇為溶劑時，黃酮類成分的提取率低于80%甲醇。故為最大效率地對全成分進行提取，選取80%甲醇作為提取溶劑；另對提取方式的考察發現，超聲提取與回流提取效果差異不大，為操作簡便，故選擇超聲提取。

在摸索色譜條件索時，確定了以甲醇-0.1%(體積分數，下同)H3PO4為流動相。但考慮到TOF/MS對不揮發性鹽的限制，擬把H3PO4改為甲酸。另由于檢測波長為238 nm，接近甲酸的末端吸收，梯度后半部分色譜圖會出現塌陷，故在流動相A、B中均加入0.05%甲酸，結果發現部分成分信號較弱。為了進一步增強化合物的電離，提高檢測靈敏度，最終把流動相改為含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶甲醇(體積比0.05∶99.95)與含2 mmol/L乙酸銨的甲酸∶水(體積比0.05∶99.95)，結果色譜峰分離度高且質譜信號較強。

木脂素類化合物是三白草中最主要的化學組成成分，也是發揮藥效作用的主要成分[7,25]，而黃酮類成分作為三白草中另一種主要化學成分，同樣具有重要的生理活性[25-26]。本實驗采用 UHPLC-Q-TOF-MS法快速分析三白草中的化學成分，鑒定了15個具有紫外吸收的化合物，其中2個有機酸類化合物、1個萜類化合物、1個生物堿類化合物、5個黃酮類化合物、7個木脂素類化合物，為三白草的質量控制及物質基礎研究提供了實驗依據，也為三白草藥材資源的進一步開發、利用奠定理論基礎。而對于未鑒定出的化合物，還有待以后深入研究。