梅歸參顆粒揮發(fā)油GC-MS分析及體外抑菌活性研究

周瑩，黃意勉 ，余泳儀，陳秋霞，關(guān)鳳坤，廖錦彬，張建軍

[1.廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)，廣東 廣州 510095]

梅歸參顆粒是廣東省第二中醫(yī)院的醫(yī)院制劑(粵藥制字Z20150010)，由辛夷、當歸、肉桂、干姜、白芷、花椒等多味中藥組成，具有溫陽益氣、補益脾肺、通竅瀉濁、活絡(luò)的功效，用于過敏性鼻炎鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞時作者，臨床療效顯著。過敏性鼻炎，又稱變應(yīng)性鼻炎，是特應(yīng)性個體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的遞質(zhì)釋放，多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的、以鼻黏膜變應(yīng)性炎癥為特征的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。過敏性鼻炎雖然不會危及患者的生命，但卻極大地影響著患者的生活質(zhì)量。據(jù)Bousquet等報道，至2001年，全球已有近四分之一的患者受此疾病的困擾[2]。過敏性鼻炎的致病因素目前尚不十分明確，比較認可的有，微生物、花粉、動物皮毛以及遺傳因素等[3-5]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，鼻腔微生物在過敏性鼻炎的發(fā)病過程中占有十分重要的地位[6]。梅歸參顆粒揮發(fā)油是梅歸參顆粒的重要組成部分，由辛夷、當歸、肉桂、干姜、白芷、花椒6味藥通過水蒸氣蒸餾法提取而得。本文對梅歸參顆粒中揮發(fā)油部位開展化學成分分析，及抗菌抑菌實驗，以期為闡明梅歸參顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

BSC-1300-II-A/B3生物安全柜(蘇州工業(yè)園區(qū)鴻基潔凈科技有限公司)；GSP-9160MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；FD50A高壓滅菌器(廣州合眾生物科技有限公司)；AUY120電子天平(SHIMADZU)；SpectraMax190全波長掃描多功能酶標儀(上海美谷子儀器有限公司)；安捷倫7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]。

1.2 藥材及菌種

標準菌種金黃色葡萄球菌(CMCC26003)、大腸埃希菌(CMCC44102)、銅綠假單胞菌(CMCC10211)、傷寒桿菌(CMCC50071)、變形桿菌(CMCC49027)、乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)均購自廣東省食品藥品檢驗所。

1.3 試劑及藥品

MHA培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；硫酸慶大霉素注射液(批號180602)購自廣州白云山天心制藥股份有限公司；10 μg慶大霉素含藥紙片購自廣州有田生物科技有限公司。

2 方法

2.1 梅歸參顆粒揮發(fā)油樣品的制備

按處方稱取當歸、肉桂、干姜、辛夷、白芷、花椒6味藥材飲片投入提取罐中，加飲片量8倍量水，浸制1 h，通入蒸氣加熱，收集揮發(fā)油5 h，分液漏斗收集揮發(fā)油。用移液槍吸取質(zhì)量濃度為954 mg/mL的梅歸參揮發(fā)油100 μL，加入MH培養(yǎng)基3 068 μL，加入32 μL吐溫80助溶，制成質(zhì)量濃度為29.8 mg/mL的藥液，即得。

2.2 培養(yǎng)基的制備

2.2.1 水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(mueller-hiinton agar，MHA)的制備 稱取本品42 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，待冷至50 ℃，傾入無菌平皿，備用。

2.2.2 水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(mueller-hinton broth，MH)的制備 稱取本品21 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

2.2.3 生理鹽水的制備 稱取NaCl 9 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

2.3 菌懸液的制備

將供試菌接種至新鮮斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，各挑取菌種到生理鹽水中，制成0.5號麥氏比濁管的菌液，其濃度為1.5×108cfu/mL。

2.4 慶大霉素溶液的制備

用移液管吸取40 μL濃度為40 mg/mL的慶大霉素到2 mL MH培養(yǎng)基中，制成濃度為0.8 mg/mL的慶大霉素溶液。

2.5 抑菌作用的測定

2.5.1 紙片擴散法[7]用打孔器將濾紙打成直徑為60 mm的圓紙片，于121 ℃滅菌30 min，備用。分別取制備好的濃度為0.5號麥氏比濁管的不同供試菌懸液0.1 mL，涂布到直徑為90 mm平板表面，再將紙片貼在平板上，分別吸取5 μL梅歸參揮發(fā)油原油到紙片上，以慶大霉素藥敏片(含藥10 μg)為陽性對照組，以溶液空白藥敏片為陰性對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次。以mm為單位，測量抑菌圈直徑，取平均值。運用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2.5.2 肉湯稀釋法測揮發(fā)油最小抑菌濃度(MIC)[8]采用微量肉湯二倍稀釋法。取10 μL備用的濃度為0.5號麥氏比濁管菌懸液至10 mL MH培養(yǎng)基中，吹打均勻，此時細菌密度約為1.0×106cfu/mL，用于MIC的測定。于96孔板中2～7號孔里加入MH培養(yǎng)基100 μL。1號孔加入200 μL質(zhì)量濃度為29.8 mg/mL的梅歸參稀釋溶液，用移液槍吸取100 μL藥液于2號孔內(nèi)，混勻。依次進行二倍稀釋至7號孔，吸取7號孔中100 μL藥液，棄之。1～7孔分別加入濃度為1.0×106cfu/mL的菌液100 μL，使孔內(nèi)的藥物終濃度分別為14.90、7.45、3.73、1.86、0.93、0.47、0.24 mg/mL。10號孔內(nèi)加入MH培養(yǎng)基200 μL作為陰性對照，11號孔內(nèi)加入100 μL MH培養(yǎng)基和100 μL菌液作陽性對照，12號孔加入質(zhì)量濃度為20 μL/mL慶大霉素溶液和100 μL菌液作陽性藥對照。另外在孔板上按上述方法依次稀釋藥液，最后加入MH培養(yǎng)基100 μL作為藥液空白對照組。每個質(zhì)量濃度平行9組，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用肉眼觀察結(jié)果。觀察各孔底部是否有細菌沉淀，無肉眼可見細菌沉淀的最小濃度可判定為梅歸參顆粒揮發(fā)油的MIC。

2.5.3 最低殺菌濃度(MBC)測定[9]根據(jù)MIC測定結(jié)果，將未見細菌生長孔的培養(yǎng)液100 μL接種到MHA平板上，涂布棒涂勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基上沒有細菌生長的藥物最低濃度為最低殺菌濃度(MBC)。

2.6 分析條件

2.6.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細管柱(30 m×250 μm,0.25 μm)，柱溫采用程序升溫，初溫50 ℃，保持2 min后以2.5 ℃/min升至200 ℃，保持6 min，再以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL，載氣為氦氣。分流比為5∶1。

2.6.2 質(zhì)譜條件 EI源電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃。倍增電壓為1.28 kV，掃描范圍為30-800原子質(zhì)量單位，掃描速率為3.8次/s，溶劑延遲3.8 min。

2.7 樣品處理

取0.25 mL梅歸參顆粒揮發(fā)油用環(huán)己烷定容到5 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，待GC-MS檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 梅歸參顆粒揮發(fā)油的濾紙片擴散法試驗結(jié)果

梅歸參顆粒揮發(fā)油對6種供試菌均有良好的抑菌作用(P<0.01)，抑菌效果見表1。由以濾紙片法測定的抑菌圈直徑為指標，評定梅歸參顆粒揮發(fā)油對6種供試菌的抑菌效果[8]：無抑菌圈者為不敏感、抑菌圈直徑<12 mm為低度敏感、抑菌圈直徑12～20 mm為中度敏感、抑菌圈直徑>20 mm為高度敏感。梅歸參顆粒揮發(fā)油對大腸埃希菌和乙型溶血性鏈球菌為高度敏感，對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌和變形桿菌為中度敏感，對銅綠假單胞菌低度敏感。由此可見，梅歸參顆粒揮發(fā)油具有顯著的抑菌作用。

表1 梅歸參顆粒揮發(fā)油紙片擴散法藥敏試驗結(jié)果

菌種揮發(fā)油組陽性對照組陰性對照組金黃色葡萄球菌17.00±1.4??##27.00±0.82??6.00±0.00大腸埃希菌23.67±1.70??22.00±0.00??6.00±0.00銅綠假單胞菌9.00±0.82??##26.33±0.47??6.00±0.00變形桿菌18.67±1.89??##25.6 7± 0.47??6.00±0.00乙型溶血性鏈球菌60.00±2.16??##30.67±1.70??6.00±0.00傷寒桿菌19.33±1.15??20.67±0.58??6.00±0.00

與陰性對照組比較：**P<0.01； 與陽性對照組比較：##P<0.01

3.2 MIC測定結(jié)果

根據(jù)抑菌圈試驗結(jié)果，用96孔板連續(xù)稀釋法進行各種供試菌的MIC實驗，結(jié)果表明梅歸參顆粒揮發(fā)油對6種供試菌均有抑菌效果，見表2。

表2 梅歸參顆粒揮發(fā)油對各種供試菌種的最小抑菌濃度

Table2MIC value of essential oils from Meiguishen granules (n=3)

菌種MIC/(mg·mL-1)金黃色葡萄球菌1.86大腸埃希菌3.73銅綠假單胞菌14.91變形桿菌3.73乙型溶血性鏈球菌1.86傷寒桿菌7.45

3.3 最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果

各供試菌的MBC測定結(jié)果見表3。

3.4 GC-MS測定結(jié)果

按照上述GC-MS條件，對梅歸參顆粒揮發(fā)油采用自動進樣，解析3 min，進行色譜分離，得到總離子流圖，見圖1。所得圖譜經(jīng)峰面積歸一化法計算各組分的相對質(zhì)量分數(shù)，對總離子流色譜圖進行分析和處理、NIST08.L譜庫檢索和查對有關(guān)資料[10-15]，鑒定各個化合物結(jié)構(gòu)與名稱，最后確定、且相對質(zhì)量分數(shù)大于0.01%的化學成分列于表4。

表3 梅歸參顆粒揮發(fā)油對各種供試菌種的最小殺菌濃度

Table3MBC value of essential oils from Meiguishen granules (n=3)

菌種MBC/(mg·mL-1)金黃色葡萄球菌7.45大腸埃希菌14.90銅綠假單胞菌7.45變形桿菌3.73乙型溶血性鏈球菌3.73傷寒桿菌14.90

98765432101020304050607080?107豐度t/min

圖1梅歸參顆粒揮發(fā)油總離子色譜圖

Figure1Total ion flow diagram of essential oils from Meiguishen granules

表4 梅歸參顆粒中揮發(fā)油化學成分信息表Table 4 Main chemical composition of essential oils from Meiguishen granules

表4 (續(xù))

4 討論

梅歸參顆粒是用于治療過敏性鼻炎的醫(yī)院制劑，臨床療效顯著。梅歸參顆粒揮發(fā)油是由梅歸參顆粒中的辛夷、當歸、肉桂、干姜、白芷、花椒6味藥通過水蒸氣蒸餾提取而得，是梅歸參顆粒的重要組成部分。實驗運用GC-MS技術(shù)對梅歸參顆粒揮發(fā)油進行成分分析鑒定，共得到138個可識別峰，鑒定出相對質(zhì)量分數(shù)≥0.1%的化學成分有25種，其中相對質(zhì)量分數(shù)>1.0%的化學成分有8種，占總揮發(fā)油的66.48%。分析結(jié)果為闡明梅歸參顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定依據(jù)，所建立的方法學為梅歸參顆粒的質(zhì)量標準提高提供了參考。

過敏性鼻炎，是特應(yīng)性個體接觸致敏原后由IgE介導(dǎo)的遞質(zhì)釋放，多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的、以鼻黏膜變應(yīng)性炎癥為特征的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。其致病因素與細菌有著密切的關(guān)系。研究報道，從慢性感染-過敏性鼻炎患者的鼻黏膜中常可分離出葡萄球菌、鏈球菌等細菌，患者鼻咽黏膜的細菌繁殖常超過健康人，從而使細菌性變應(yīng)性病變遷延，并促使其轉(zhuǎn)為慢性[16]。陳蕙芳等[17]報道，有一植物組方可以殺死引起鼻炎的有害菌，并在鼻腔中形成一層保護膜防止繼發(fā)性細菌感染，防止鼻炎復(fù)發(fā)。基于細菌對過敏性鼻炎的影響，為了更好地闡明梅歸參顆粒用于治療過敏性鼻炎的藥理作用和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，研究開展了梅歸參顆粒揮發(fā)油對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、乙型溶血性鏈球菌、傷寒桿菌6種致病菌的體外抑制活性研究。結(jié)果表明：梅歸參顆粒揮發(fā)油對6種試驗菌均有顯著的抑制作用；濾紙片擴散法實驗結(jié)果顯示對乙型溶血性鏈球菌的抑制作用尤為顯著，優(yōu)于陽性對照10 μg的慶大霉素紙片。本研究為闡明梅歸參顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了一定的基礎(chǔ)，但體內(nèi)抗菌效果及抗菌的作用機制還有待進一步研究。