蝙蝠葛堿對BxPC-3細胞的增殖和遷移作用及其對ERK信號通路的影響

劉萍，白云，武傳秀，何曉桐，蘇昊達，郭林巖

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)多起源于腺管上皮,發病隱匿，侵襲性強，是一種發病率和治愈率低的惡性腫瘤疾病[1]。近年來報道，由于環境和飲食習慣的影響，其死亡率逐年上升[2]。由于胰腺癌早期難發現，手術和放、化療等手段患者5年內生存率較差[3]，給患者帶來越來越多身體與精神上的痛苦。因此，開發有效地治療胰腺癌的藥物是目前醫藥研究的熱點課題，日益受到醫藥研究人員的重視。

ERK通路參與調控細胞惡變，以及腫瘤浸潤和轉移[4]。惡性腫瘤的發生發展、侵襲等過程，都與ERK通路密切相關。有研究表明，ERK通路可能參與了惡性腫瘤細胞的耐藥過程[5]。消化系統腫瘤胰腺癌，其惡性程度極高。胰腺癌細胞的耐藥性、細胞遷移、細胞增殖等過程都與ERK通路關系密切[7]。

蝙蝠葛堿(Dau)又稱北豆根堿，是從中藥北豆根中提純出的有效單體成分[4]。在前期工作的大量積累上[8-10]，本實驗從體外培養BxPC-3細胞株入手，用Dau對胰腺癌BxPC-3細胞進行干預，并從基因和蛋白水平對ERK信號通路的關鍵因子Raf和MEK1進行檢測，探討Dau對胰腺癌BxPC-3細胞的增殖和遷移抑制作用與ERK信號通路的相關性。為多方面、多手段治療胰腺癌奠定實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞

人胰腺癌BxPC-3細胞株來自于上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑

Dau溶液(成都曼思特生物科技有限公司)；5-FU溶液(美國Sigma公司)；5 mg/mL MTT溶液(美國Sigma公司)；改良型RPMI-1640培養基(美國HyClone公司)；青霉素及鏈霉素(美國HyClone公司)；其他試劑均為進口或國產分析純級。

1.3 主要儀器

實時熒光定量PCR檢測儀T100(美國伯樂公司)；垂直電泳儀及轉模系統(美國Bio Rod公司)；1-6P低速離心機(無錫瑞江分析儀器有限公司)；Qi3536血細胞計數器(上海安信光學儀器制造有限公司)；310型CO2培養箱超凈工作臺(力康發展公司)；BS124S型分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養

將處于對數生長期的胰腺癌細胞BxPC-3用胰蛋白酶進行消化。調至濃度為1×105個/mL的單細胞懸液，培養24 h后，棄去培養液。分4組分別給藥，給藥后再次放入培養箱中培養48 h，備用。

2.2 藥物劑量與實驗分組

應用胰蛋白酶對處于對數生長期的人胰腺癌細胞株BxPC-3進行消化。再用PBS液清洗3次，并且制成濃度為1×105個/mL的單細胞懸液。分別接種于4個培養瓶，間隔24 h后從培養箱取出。棄去培養液分組給藥：Dau高劑量組為終質量濃度48 μg/mL的Dau培養液；Dau低劑量組為終濃度24 μg/mL的Dau培養液；5-FU組為終濃度50 μg/mL的5-FU培養液；Control組為常規培養液。給藥后放于細胞培養箱中48 h。

2.3 細胞劃痕實驗

用油性筆在6孔板背面劃線每孔保證不少于3條，每條線間隔0.5～1 cm。用移液槍將培養好的細胞移入孔中并放于37 ℃、5%(φ)CO2培養箱繼續培養24 h后取出。用移液槍頭垂直6孔板背面的橫線進行劃痕。以PBS液洗滌各孔，重復洗3次。在除去劃掉的細胞后，按“2.2”方法分別給藥。每組再次各設4個復孔，2 d后，每間隔24 h對劃痕位置進行拍照記錄。位置隨機，以上步驟重復2～3次。使用E-Ruler圖像處理軟件測出劃痕距離。以劃痕愈合百分比反映BxPC-3細胞株的遷移運動能力。

2.4 MTT法檢測胰腺癌細胞株BxPC-3的細胞增殖

取上述終濃度的單細胞懸液，分別取100 μL滴加于96孔培養板。培養24 h后，棄培養液，進行給藥干預。給藥后放于37 ℃、5%CO2培養箱48 h。每組各設6個復孔，每孔加液量為100 μL。繼續培養44 h后，向各培養孔滴加10 μL的MTT(5 mg/mL)溶液。再次培養4 h后終止培養。棄去培養液，向各孔滴加100 μL的DMSO。置于搖床震蕩直至結晶物溶解。調節波長至490 nm，檢測各孔的吸光度A值。重復進行3次，分析給藥組對BxPC-3細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(1-實驗組A值/Control組A值)×100%

2.5 Real-time PCR法檢測BxPC-3細胞中Raf mRNA和MEK1 mRNA的表達

按Trizol試劑盒說明書抽提總RNA，從總RNA中吸取2 μL，與98 μL的DEPC水使其稀釋50倍。應用紫外分光光度計，以DEPC水調零，測定RNA的濃度和純度。按PrimeScripr RT試劑盒說明書，進行cDNA第一鏈的合成。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，引物具體序列如下：Raf基因(上游：5′-GTGGATGAT GCCTTTGCTCG-3′,下游：5′-CCATCGGCGTTCCC ATACTT-3′);MEK1基因(上游：5′-CCGCTCAAA TACCTTCACAA-3′,下游：5′-ATTACGGATTTGGTCG TATTGG-3′);GAPDH基因(上游：5′-AACGGATTT GGTCGTATTGG-3′,下游：5′-TGGAAGATGGTGAT GGGATT-3′)。

PCR反應條件：從第2階段，共擴增40個循環。收集反應過程中的熒光信號，應用光學系統軟件(iQ 5)進行分析。檢測各樣品的循環閾值(threshold cycle，Ct)，其Ct值與模板濃度成反比。將所有樣品設3個復孔，取平均Ct值并重復3次。分析其產物的SYBR熔解曲線，判斷PCR反應的特異性。可得出目的基因(Raf、MEK1)對比內參基因(GAPDH)的表達量?！鳌鰿t=△Ct(給藥組樣品)-△Ct(未給藥組樣品)；給藥組樣品目的基因和未給藥組樣品目的基因之間的表達差異為2-△△Ct倍。

2.6 數據統計及分析

2.7 Western blot法檢測BxPC-3細胞中Raf蛋白和MEK1蛋白的表達

按蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取總蛋白，以微孔酶標儀法，測定總蛋白濃度。依照BCA濃度測定試劑盒說明書操作，測得蛋白濃度。計算出所需細胞抽提試劑、Buffer的用量。最終確定以5 μL Marker與各組蛋白樣品分別加入孔中?？湛准?×SDS上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳(75 V，1 h)，嚴格按照跑膠順序及操作步驟進行。將電轉槽放于冰浴中(水、冰袋)，進行轉膜(75 V，2 h)，取出NC膜后，可見預染的Marker條帶，加一抗(5%脫脂牛奶稀釋)后，封住新薄膜袋。棄一抗，以TBST搖床洗膜10 min(重復3次)，移至二抗工作液中，置于分子雜交箱(UVP)，以37 ℃孵育1 h。棄二抗，以TBST搖床洗膜10 min(重復3次)。暗室關閉日光燈后，向NC膜滴加超敏發光液。蓋上保鮮膜，對應放上X光膠片(剪掉上角標記)。蓋上暗盒計時，曝光后放入顯影液觀察。搖動膠片至顯影后，放入定影液。清水沖洗后，分類保存膠片。掃描膠片得到圖形，由Image-pro plus軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值(目的蛋白A值/GAPDH A值)，來表示蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 Dau對BxPC-3細胞遷移能力的影響

表1顯示，Dau高、低劑量組愈合百分比分別為28.24%、33.28%，5-FU組愈合百分比34.20%，各組與Control組比較，愈合百分比均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。細胞劃痕實驗結果見圖1。

Control5-FUD24D480h24h48h

圖1 細胞劃痕實驗圖片Figure 1 Picture of cell scratch experiment

與Control組比較：**P<0.01。

3.2 Dau對胰腺癌細胞株BxPC-3細胞增殖的影響

表2實驗結果表明，Dau高、低劑量組的細胞增殖抑制率為(70.81±1.21)%、(44.98±2.08)%，與Control組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；5-FU組的細胞增殖抑制率為(58.50±3.34)%,與Control組比較，差異無統計學意義。

3.3 RT-PCR檢測結果

3.3.1 鑒定總RNA的完整性和純度 如圖2所示，經凝膠電泳后，總RNA比較清晰的顯示3條條帶(28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA)。說明提取的RNA比較完整，未降解。點狀槽內或槽附近未見熒光區帶，說明提取的RNA中DNA未被污染。應用核酸蛋白紫外分析儀(DU-800)，檢測各組RNA樣品的質量。得出A260、A280、A260/A280數值，進行各組RNA樣品的濃度計算。各組RNA樣品的A260/A280都位于1.8～2.0區間內，說明各組RNA樣品的純度良好。

表2 Dau對BxPC-3細胞增殖的影響Table 2 Effect of Dau on the proliferation of BxPC-3 cells

與Control組比較：**P<0.01。

123428SrRNA18SrRNA5SrRNA

1. Dau高劑量組； 2. Dau低劑量組； 3. 5-FU組； 4.對照組。

圖2總RNA凝膠電泳圖
Figure2Total RNA gel electrophoretogram

3.3.2 Dau對BxPC-3細胞RafmRNA表達的影響 表3結果表明，各組與Control組比較，Dau高、低劑量組、5-FU組RafmRNA表達均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 Dau對BxPC-3細胞RafmRNA表達的調控

Table1Regulation of Dau onRafmRNA expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)△Ct△△CtRaf mRNA表達Dau高劑量組484.09±0.082.75±0.080.15±0.01?? 低劑量組242.11±0.050.77±0.050.59±0.02??5-FU組502.48±0.091.13±0.090.46±0.03??Control組-1.35±0.030.00±0.031.00±0.02

與Control組比較：**P<0.01。

3.3.3 Dau對BxPC-3細胞MEK1 mRNA表達的影響 表4所示，各組與Control組比較，Dau高、低劑量組和5-FU組MEK1 mRNA表達均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 Dau對BxPC-3細胞MEK1 mRNA表達的調控

Table4Regulation of Dau onMEK1 mRNA expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)△Ct△△CtMEK1 mRNA表達Dau高劑量組484.53±0.493.29±0.490.11±0.04?? 低劑量組242.29±0.041.06±0.040.48±0.01??5-FU組502.40±0.261.17±0.260.45±0.08??Control組-1.23±0.42-0.00±0.421.03±0.28

與Control組比較：**P<0.01。

3.4 Western blot結果

3.4.1 Dau對BxPC-3細胞Raf蛋白表達的影響 圖3、表5結果表明，各組與Control組比較，Dau高劑量組和5-FU組Raf 蛋白表達明顯降低，具有極顯著差異(P<0.01)。Dau低劑量組蛋白表達有所降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

RafGAPDH74?103146?1031234

1. Dau高劑量組； 2. 5-FU組； 3. Dau低劑量組； 4.對照組。

圖3各組Raf、GAPDH蛋白的表達

Figure3Expression of Raf and GAPDH proteins in each group

表5 Dau對胰腺癌BxPC-3細胞Raf蛋白表達的調控

Table5Regulation of Dau on Raf protein expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)Raf/GAPDH(A值)Dau高劑量組480.94±0.17?? 低劑量組241.26±0.19?5-FU組501.23±0.09??Control組-1.68±0.16

與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.4.2 Dau對BxPC-3細胞MEK1蛋白表達的影響 圖4、表6所示，與Control組比較，Dau高、低劑量組和5-FU組的MEK1 蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

44?103146?103GAPDHMEK11234

1. Dau高劑量組； 2. 5-FU組； 3. Dau低劑量組； 4.對照組。

圖4各組MEK1、GAPDH蛋白的表達

Figure4Expression of Raf and GAPDH proteins in each group

表6 Dau對胰腺癌BxPC-3細胞MEK1蛋白表達的調控

Table6Regulation of Dau on MEK1 protein expression in BxPC-3 cells

組別劑量/(μg·mL-1)MEK1/GAPDH(A值)Dau高劑量組480.60±0.03?? 低劑量組240.70±0.09??5-FU組500.72±0.10?? Control組-1.25±0.14

與Control組比較:**P<0.01。

4 討論

本研究以細胞劃痕方法檢測細胞遷移能力，結果表明各給藥組愈合距離明顯減小、愈合較慢，提示Dau能夠顯著降低BxPC-3細胞的遷移能力。采用PCR及Western blot技術檢測Raf和MEK1 mRNA及蛋白的表達結果表明Dau能夠明顯抑制ERK信號通路關鍵位點Raf和MEK1 mRNA及蛋白的表達。由此推斷Dau可能通過影響ERK信號通路發揮其對胰腺癌BxPC-3細胞的增殖和遷移作用。

ERK傳導通路是研究腫瘤細胞內主要信號傳遞系統之一[11-12]。其中惡性腫瘤細胞的遷移，都與其細胞的運動能力有關。腫瘤是在致瘤因子作用下，機體的組織細胞異常增生所形成的新生物，也稱贅生物。臨床將其分為2種：一是不轉移、生長緩慢、有包膜且邊界清楚的良性腫瘤；二是易轉移、生長迅速、侵襲生長且邊界不清的惡性腫瘤。大量文獻已表明，ERK通路參與調控細胞惡變，惡性腫瘤的發生發展、侵襲、轉移等過程都與ERK通路相關[13-14]。該通路接收來自多種生長因子如PDGF、NGF等的上游信號，經級聯反應，調控核轉錄因子如NF-κB、AP-1的表達[15]。

有研究表明，干預ERK通路3種激酶(Raf、MEK、ERK)中的任何一個，都能阻斷通路，進而抑制惡性腫瘤的增殖[16-17]。此通路位于信號(細胞增殖、分化及遷移)傳導網絡的核心[18]，這也是作為切入點的關鍵依據之一[19]。經研究發現，ERK信號傳導通路相關因子在多數腫瘤細胞中呈高表達，在促使細胞增殖、遷移、侵襲過程中發揮關鍵作用。若以藥物干預ERK通路上任一關鍵激酶，使其阻斷信號通路，從而抑制其通路中關鍵因子的表達，就有可能對其癌細胞產生、增殖、轉移起到一定抑制作用，從而治療胰腺癌。

對于胰腺癌病因和ERK通路作用機制仍須進一步深入研究，今后可以采用基因芯片技術進一步系統分析Dau對BxPC-3細胞mRNA表達譜影響，開展Dau與基因的代謝通路、傳導通路相關性研究，以期為臨床提供有效的靶向治療新藥。