SNAI1對內(nèi)胚層分化命運和細胞遷移能力的影響

李秋鴻，黃清松，毛建文

(廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

人胚胎干細胞(hESCs)來源于人囊胚內(nèi)細胞團，在體外培養(yǎng)時具有自我更新和多向分化的潛能，其體外分化的過程可再現(xiàn)早期胚胎發(fā)育的各個階段[1-3]。定型內(nèi)胚層細胞是包括甲狀腺、肺、胰腺、肝臟和腸道在內(nèi)等器官的胚胎前體[4]。不管是脊椎動物的體內(nèi)胚胎發(fā)育還是人多能干細胞的體外定向分化，定型內(nèi)胚層的產(chǎn)生都必須依賴于TGF-β/nodal/activin信號通路的激活[5]。該信號通路的激活往往伴隨著細胞遷移運動的發(fā)生，細胞運動是一個非常復雜的過程，表現(xiàn)為細胞形態(tài)、黏附和遷移能力等方面的變化[6-9]。在體外，將人胚胎干細胞定向分化為定型內(nèi)胚層[10]或中胚層[11]的過程中都可以檢測出與細胞運動有關的表面蛋白表達發(fā)生變化，例如E-cadherin、N-cadherin等。在胚胎發(fā)育過程中，鋅指蛋白SNAIL家族的激活能夠促進細胞發(fā)生遷移運動[12]，體外定型內(nèi)胚層細胞運動能力的獲得與SNAIL家族之間的關系目前報道較少。為了研究SNAIL家族在定型內(nèi)胚層分化過程中的作用，本實驗通過干擾SNAI1基因的表達，探討SNAI1與定型內(nèi)胚層命運及與細胞運動之間的關系。

1 材料

1.1 細胞

人胚胎干細胞細胞株H1購于威斯康星州WiCell研究所(Wicell,Madison,WI)。

1.2 主要試劑

mTeSR1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)；Matrigel基底膠(BD Biosciences)；Accutase細胞消化液(Sigma)；RPMI/B27培養(yǎng)基(Gibco)；激活素A(Peprotech)； FBS (HyClone)；DAPI(Sigma)；FOXA2抗體(R&D system)；小鼠來源的SNAI1單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；HRP標記的羊抗兔二抗、Alexa Fluor?488 標記的驢抗羊二抗(Invitrogen)；Trizol試劑(MRC)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO)；SYBR Premix Ex Taq Kit(TAKARA)；western化學顯色試劑盒(MILLIPORE)；siSNAI1-1#(銳博生物)；siSNAI1-2#(銳博生物)；轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX(Thermo scientific)。

1.3 主要儀器

Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss)；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將人胚胎干細胞系H1接種于鋪有Matrigel基底膠的6孔板上，加入mTeSR1培養(yǎng)基在37 ℃、5%(φ)CO2的條件下培養(yǎng)，每天換液。當培養(yǎng)板中細胞密度較大時，按照1∶4～1∶6的比例用Accutase細胞消化液進行傳代。

2.2 定型內(nèi)胚層分化

在24孔板中提前半小時預先鋪好Matrigel基底膠，將6孔板中密度達50%左右的H1細胞用Accutase消化液進行消化，細胞密度以第2天細胞接近鋪滿整個培養(yǎng)孔為宜。細胞貼壁成功并鋪滿整個培養(yǎng)孔后加入含有50 ng/mL Activin A重組蛋白的RPMI/B27培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)3 d，每天更換新鮮的分化培養(yǎng)基[13]。

2.3 siRNA轉染

嚴格按照轉染試劑 Lipofectamine RNAiMAX 說明書的操作步驟進行。

2.4 Western blot檢測siRNA對SNAI1蛋白的干擾效果

收集細胞并裂解蛋白進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人SNAI1多克隆抗體，4 ℃條件下孵育過夜，TBS /T清洗3次，加入相對應的HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS/T清洗3次，滴加顯影液和定影液于暗室中顯影成像。

2.5 qRT-PCR檢測FOXA2、GATA4/6、KLF8、TGFβ1、SNAI1等基因的表達

將在24孔板中培養(yǎng)的H1細胞向內(nèi)胚層定向誘導3 d后，吸棄培養(yǎng)基上清液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔中加入約1 mL Trizol試劑，反復吹打直至細胞完全溶解。加入氯仿分層，取水相至預冷的異丙醇中獲得總RNA沉淀，洗滌晾干，將RNA沉淀重新溶于蒸餾水，測定濃度。根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書操作，取2 μg總RNA將其反轉為cDNA并適度稀釋，用作PCR模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit進行qPCR反應，內(nèi)參為GAPDH。所用引物的序列如下：FOXA2，5′-ACTACCCCGGCTACGGTTC-3′(正向)，5′-AGGCCCGTTTTGTTCGTGA-3′(反向);GATA4，5′-CGACACCCCAATCTCGATATG-3′(正向)，5′-GTTGCACAGATAGTGACCCGT-3′(反向)；GATA6，5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′ (正向)，5′-GTC GAGGTCAGTGAACAGCA-3′(反向)；KLF8，5′-CCCAAGTGGAACCAGTTGACC-3′(正向)，5′-GAC GTGGACACCACAAGGG-3′(反向)；TGFβ1，5′-CTAATGGTGGAAACCCACAACG-3′(正向)，5′-TATCGC CAGGAATTGTTGCTG-3′(反向)；SNAI1，5′-ACTGCA ACAAGGAATACCTCAG-3′(正向)，5′-GCACTG GTACTTCTTGACATCTG-3′(反向);GAPDH，5′-AGG GCTGCTTTTAACTCTGGT-3′(正向)，5′-CCCCACTTG ATTTTGGAGGGA-3′ (反向)。

2.6 免疫熒光檢測FOXA2蛋白的表達

4%多聚甲醛固定細胞，處理30 min后用PBS清洗3次，然后加入0.3% Triton X-100/PBS溶液通透30 min，PBS清洗3次，加入10% FBS/PBS溶液室溫孵育1 h。加入羊抗人BFOXA2一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS清洗3次，加入相對應的Alexa Fluor?488 標記的驢抗羊免疫熒光二抗，避光孵育2 h，PBS清洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3次,封片。使用Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡進行觀察和拍照。

2.7 細胞遷移運動能力檢測

采用劃痕法測定內(nèi)胚層定向分化第3天的細胞遷移運動能力：用無菌針頭快速劃過單層培養(yǎng)的細胞表面，形成無細胞區(qū)，該區(qū)域附近的細胞可以向無細胞區(qū)遷移運動，拍照、測量起始的無細胞區(qū)的邊界距離，然后將細胞放置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再取出拍照、測量無細胞區(qū)邊界距離，由此可計算出細胞24 h內(nèi)的遷移距離。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 驗證siSNAI1的干擾效果

將hESCs誘導為內(nèi)胚層細胞的過程中加入干擾SNAI1表達的siRNA，與正常對照相比，分化第3天細胞內(nèi)SNAI1基因的mRNA含量顯著下降(P<0.01)，見圖1。通過蛋白免疫印跡法也證實分化第3天內(nèi)胚層細胞中SNAI1蛋白的表達受到明顯抑制，見圖2。

0123t/d0.00200.00150.00100.00050.0000相對表達量NCsiSNAI1-1siSNAI1-2SNAI1**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：**P<0.01。

圖1分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細胞內(nèi)SNAI1基因的mRNA含量

Figure1Gene expression ofSNAI1 after siSNAI1 treatment in endoderm differentiation

3.2 干擾SNAI1基因的表達對FOXA2表達的影響

在內(nèi)胚層細胞分化過程中，F(xiàn)OXA2在分化第2天左右就會發(fā)生上調(diào)，分化第3天在細胞中高表達。阻礙SNAI1基因的表達導致FOXA2在第2天左右上調(diào)失敗(P<0.05)，直接影響分化第3天FOXA2在細胞中的表達量(P<0.05)，結果見圖3。細胞免疫熒光檢測分化第3天細胞內(nèi)FOXA2蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，siRNA處理的細胞幾乎不表達FOXA2，說明細胞的內(nèi)胚層分化命運受到抑制，見圖4。

0123SNAI1GAPDH

1. hESCs; 2. siSNAI1-1 D3; 3. siSNAI1-2 D3; 4. NC D3。

圖2經(jīng)siSNAI1處理后細胞內(nèi)SNAI1蛋白含量

Figure2IntracellularSNAI1 protein content after siSNAI1 treatment

0123t/dNCsiSNAI1-1siSNAI1-2FOXA20.0160.0120.0080.0040.000相對表達量**

與siSNAI1-1組、siSNAI1-2組比較：*P<0.05。

圖3分化過程中經(jīng)siSNAI1處理后細胞表達FOXA2的情況

Figure3Expression ofFOXA2 mRNA in siSNAI1-treated cells during endodermal differentiation

圖4經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞表達FOXA2蛋白的情況

Figure4Expression of FOXA2 protein in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.3 干擾SNAI1基因的表達對GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8 mRNA表達的影響

為了進一步驗證SNAI1基因的表達受阻對內(nèi)胚層細胞命運的影響，利用實時熒光定量PCR檢測細胞中GATA4、GATA6的mRNA表達情況發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，siRNA處理的細胞中內(nèi)胚層標記基因GATA4、GATA6的表達非常低(P<0.01)。同時qRT-PCR結果還表明與細胞運動相關的基因TGFβ1、KLF8的表達也受到影響(P<0.01)，見圖5。

0.00040.00030.00020.000100.0040.0030.0020.0010相對表達量0.0120.0100.0080.0060.0040.0020相對表達量0.000250.000200.000150.000100.000050GATA4GATA6TGFβ1KLF8NCD3siSNAI1-1siSNAI1-2****************

與NC組比較：**P<0.01。

圖5經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞表達GATA4、GATA6、TGFβ1、KLF8的情況

Figure1Expression ofGATA4、GATA6、TGFβ1 andKLF8 mRNA in siSNAI1-treated cells at 3 days

3.4 干擾SNAI1基因的表達對細胞遷移運動能力的影響

如圖6所示，將hESCs誘導為內(nèi)胚層細胞的過程中，細胞會獲得遷移運動能力，細胞由上皮狀態(tài)轉變?yōu)殚g充質狀態(tài)。加入干擾SNAI1表達的siRNA后，細胞的遷移運動能力受到明顯限制(P<0.01)。

****siSNAI1-2D3siSNAI1-1D3NCD3400300200100024h遷移距離/?m

與NC組比較：**P<0.01。

圖6經(jīng)siSNAI1處理3 d后細胞遷移運動能力的變化

Figure6Cell migration assay after siSNAI1 treatment at 3 days

4 討論

原腸胚期是動物胚胎發(fā)育過程中的一個重要階段，此時外、中、內(nèi)3個胚層開始出現(xiàn)，盡管內(nèi)胚層細胞的數(shù)量在胚胎總細胞數(shù)中占比不高[14]，但是卻能夠產(chǎn)生機體中的大部分內(nèi)臟器官。盡管這些內(nèi)臟器官在形態(tài)和功能上存在差異，但它們的形成都與細胞的遷移運動密不可分[15]。SNAI1對于細胞的運動至關重要，干擾SNAI1的表達會導致細胞形態(tài)、功能發(fā)生改變，甚至是遷移運動能力的喪失[16- 17]。研究發(fā)現(xiàn)SNAI1敲除的小鼠胚胎無法正常出生，推測可能與原腸胚期細胞遷移運動過程受阻有關[18]，而在小鼠的胚胎干細胞(mESCs)中異位過表達SNAI1則會促進細胞發(fā)生遷移運動[19]。

胚胎干細胞是由囊胚內(nèi)細胞團衍生而來，能夠分化為內(nèi)、中、外原始三胚層來源的多種類型的細胞，是未來細胞治療的重要資源。然而干細胞真正的臨床研究進展緩慢，其應用還存在不少安全問題，這主要是由于人們對分化過程的本質及機制的認識還非常有限[20]。以內(nèi)胚層分化為例，研究發(fā)現(xiàn)將人胚胎干細胞定向分化為內(nèi)胚層細胞的過程中可以觀察到細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，這些細胞還具有與體內(nèi)分化細胞相似的遷移運動能力，盡管細胞運動與其命運之間有何聯(lián)系尚不清楚。

本實驗利用RNA干擾技術，通過抑制SNAI1的表達，探討SNAI1對定型內(nèi)胚層分化過程的影響及其在細胞遷移運動中所起的作用。實驗結果發(fā)現(xiàn)干擾SNAI1的表達會阻礙內(nèi)胚層的定向分化過程，定型內(nèi)胚層譜系命運轉變過程嚴重受阻，分化的細胞幾乎不表達定型內(nèi)胚層的標志蛋白，同時與細胞運動有關的基因表達明顯下調(diào)，細胞的遷移運動能力有限。由此說明SNAI1不僅在定型內(nèi)胚層分化過程中起著決定細胞命運的作用，還能夠阻止細胞獲得相應的遷移運動能力。推測細胞獲得遷移運動能力可能是人胚胎干細胞成功分化為定型內(nèi)胚層細胞的前提。