不同蛋白酶水解小米分離蛋白工藝

張建萍，陳振家，閆舟，王美玉，王玥，劉恩岐*

1. 徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（徐州 221111）；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（太谷 030801）

谷子又稱為栗，是山西省的主要農(nóng)作物之一，也是古代的“谷神”，更是中華民族上下五千年歷史中占有重要地位的旱作農(nóng)作物[1]。將谷子脫殼，就制成小米，小米不僅營養(yǎng)全面，而且也是絕佳的保健食品。小米蛋白是一種低敏性無過敏原蛋白，近年來國內(nèi)一些專家學(xué)者開始轉(zhuǎn)向?qū)π∶椎鞍椎难芯縖2]。隨著對小米保健功能、營養(yǎng)特性的關(guān)注，小米多肽出現(xiàn)在人們視線中。小米多肽是指小米蛋白經(jīng)過酶解或者微生物技術(shù)等處理方式所得到的酶解產(chǎn)物，即形成不同分子量的多肽段；與小米蛋白相比，小米多肽具有易于消化吸收、可降低膽固醇含量、促進(jìn)脂肪代謝的生理功能，營養(yǎng)價(jià)值更高[3-4]。研究指出小米蛋白提取堿法優(yōu)于鹽法[5]，使用超聲輔助后小米蛋白的提取率顯著提高[6]，試驗(yàn)采用堿提酸溶法并加以超聲輔助提取小米蛋白[7-8]。采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶來水解小米蛋白，以水解度為衡量，獲得產(chǎn)量更大的多肽混合物，以便后續(xù)對小米多肽功能特性的研究，并采用OPA法測定小米蛋白水解度[9-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小米（晉谷21號，山西晉中樂民恒興雜糧加工廠）。

1.2 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

試劑均為分析純，均用普通蒸餾水配制即可。

石油醚（沸程30～60 ℃）、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、尿素、甲醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；蛋白酶（酶活力＞10萬 U/g）、堿性蛋白酶（酶活力＞20萬 U/g）、對二苯甲醛（OPA）、硫蘇糖醇（DTT）、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G-250（考馬斯亮藍(lán)比色法用）、牛血清蛋白、SDS、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、Tris、APS、氨基乙酸、低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kD）：Solarbio品牌。

小型高速粉碎機(jī)（YS-04 A，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ 5200 DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；pH酸度計(jì)（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；723可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限儀器公司）；DYY-7 C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；DYCZ-4 OG型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小米蛋白粉制備

將小米粉碎，用石油醚攪拌脫脂，真空抽濾得到脫脂小米粉；稱取適量脫脂小米粉，以1︰8固液比加入蒸餾水，攪拌均勻后調(diào)節(jié)pH 9.0，浸提2 h；50 ℃在50 W功率下，超聲提取10 min，4 000 r/min離心15 min；取上清液調(diào)節(jié)pH 4.5，靜置2 h；棄去上清液，4 000 r/min離心10 min；棄去上清液，水洗2次，沉淀即為小米蛋白粗提物；將制得的蛋白粗提物配成200 mL溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH 7.0，勻漿機(jī)勻漿至出現(xiàn)大量泡沫，調(diào)節(jié)pH 7.0，真空冷凍干燥所得的中性溶液，即得到小米蛋白粉。

1.3.2 水解反應(yīng)單因素試驗(yàn)

配制濃度為1%的蛋白溶液，按照[E]/[S]為0.5%，1.0%，5.0%，10.0%和20.0%比例加入堿性蛋白酶，置于35，40，45，50和55 ℃水浴鍋中，在pH 7，8，9，10和11條件下進(jìn)行水解，分別在酶解0，5，10，15，20，25，30，40，50和60 min時(shí)進(jìn)行取樣，取樣后立即將酶解液置于85 ℃滅酶10 min。

按照[E]/[S]為0.5%，1.0%，5.0%，10.0%和20.0%比例在濃度1%蛋白溶液中加入胃蛋白酶，置于25，30，35，40和45 ℃水浴鍋中，在pH 0，1，2，3和4條件下進(jìn)行水解，分別在酶解0，5，10，15，20，25，30，40，50和60 min時(shí)進(jìn)行取樣，取樣后立即將酶解液置于85 ℃滅酶10 min。

1.3.3 OPA法

波長選擇。選擇340 nm作為小米蛋白水解度測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0，400，480，560，640，720和800 μL L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，不足800 μ L的加水補(bǔ)足，分別加入6 mL OPA試劑，混合均勻，反應(yīng)2 min后，在340 nm下測定其吸光度，以絲氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

水解液水解度的測定。取200 μL水解液，稀釋至測得的數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，取800 μL稀釋水解液，加入6 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，測得吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出Cserine-NH2（mmol/g），利用式（1）～（3）計(jì)算水解度。

式中：Cserine-NH2為每克蛋白中所含有L-絲氨酸含量，mmol/g；X為樣品質(zhì)量，g；P%為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V為樣品中水解液體積，L；N為水解液的稀釋倍數(shù)；H為水解過程中，每克小米蛋白被斷裂肽鍵數(shù)目，mmol/g；Wserine-NH2，即Htot，為小米蛋白中含有的總肽鍵數(shù)目，mmol/g；α、β均為修正因子，α視為常數(shù)1.00，β為每次測在0 min時(shí)所測定的水解度吸光度的平均值。

1.3.4 小米蛋白組分SDA-PAGE電泳[12]

組裝電泳裝置→制分離膠→制濃縮膠→加入緩沖液→上樣→通電源→固定→染色→脫色→成像分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小米蛋白水解時(shí)間的確定

2.1.1 胃蛋白酶水解時(shí)間確定

由圖1可知，胃蛋白酶在蛋白濃度1%，[E]/[S]=10%，pH 2，溫度35 ℃條件下進(jìn)行水解，在1 h內(nèi)水解度呈現(xiàn)急速增長狀態(tài)，而2～6 h時(shí)水解度呈現(xiàn)極其緩慢上升趨勢；從圖2該水解反應(yīng)所對應(yīng)的電泳圖譜可見，水解過程進(jìn)行1 h，大分子量的肽水解完全，水解2～6 h過程中，水解所形成的小肽基本不再發(fā)生變化，所以對于試驗(yàn)來講，只要測定胃蛋白酶在1 h內(nèi)的水解度變化便可以找到最佳水解溫度、pH及底物濃度[E]/[S]最適比例。

圖1 不同時(shí)間胃蛋白酶的水解度

圖2 不同時(shí)間胃蛋白酶水解小米蛋白電泳圖

2.1.2 堿性蛋白酶水解時(shí)間確定

由圖3可知，堿性蛋白酶在蛋白濃度1%，[E]/[S]=10%，pH 9，溫度45 ℃條件下進(jìn)行水解，在1 h內(nèi)水解度呈現(xiàn)急速增長狀態(tài)，而2～6 h時(shí)水解度呈現(xiàn)比較緩慢上升趨勢；從圖4該水解反應(yīng)所對應(yīng)的電泳圖譜可見，水解過程進(jìn)行1 h，大分子量的肽早已水解完全，水解2～6 h，水解所形成的小分子肽基本沒有發(fā)生變化，所以試驗(yàn)只要測定堿性蛋白酶在1 h內(nèi)的水解度變化，便可找到最佳水解溫度、pH及底物濃度[E]/[S]最適比例。

2.2 胃蛋白酶水解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同底物濃度對胃蛋白酶水解度的影響

由圖5可知，胃蛋白酶在pH 2，溫度35 ℃，僅以底物濃度[E]/[S]比例為變量的單因素試驗(yàn)中，隨著底物濃度升高，水解度呈上升趨勢，但底物濃度比例上升至10%和20%時(shí)的水解度變化不是很大，為在相同條件下，能用較少酶量就可達(dá)到相接近的效果，所以選擇底物濃度[E]/[S]=10%為最佳水解條件。

圖3 不同時(shí)間堿性蛋白酶的水解度

圖4 不同時(shí)間堿性蛋白酶水解小米蛋白電泳圖

圖5 不同底物濃度下胃蛋白酶的水解度

2.2.2 不同溫度對胃蛋白酶水解度的影響

由圖6可知，胃蛋白酶在底物濃度[E]/[S]=10%，pH 2，僅以溫度為變量的單因素試驗(yàn)中，在1 h水解過程中，隨著溫度上升，在25～35 ℃水解度呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，但在35～45 ℃水解度變化不明顯，所以水解溫度選取35 ℃為胃蛋白酶最佳水解溫度，在相同前提條件下，選擇較低溫度便可達(dá)到相接近結(jié)果，節(jié)能且高效。

圖6 不同溫度下胃蛋白酶的水解度

2.2.3 不同pH對胃蛋白酶水解度的影響

由圖7可知，胃蛋白酶底物度[E]/[S]=10%，溫度35 ℃，僅以pH為變量的單因素試驗(yàn)中，在1 h水解過程中，隨著pH升高水解度逐漸增高，但在pH 2，1和0時(shí)水解度的上升趨勢極度緩慢，所以pH 2為胃蛋白酶最佳水解pH，在相同前提條件下，選擇較低pH即可達(dá)到相接近的效果，條件較為溫和。

圖7 不同pH下胃蛋白酶的水解度

2.3 堿性蛋白酶水解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同底物濃度對堿性蛋白酶水解度的影響

由圖8可知，胃蛋白酶在pH 2，溫度35 ℃，僅以底物濃度[E]/[S]比例為變量的單因素試驗(yàn)中，隨著底物濃度升高，堿性蛋白酶水解度先快速升高后下降，[E]/[S]=10%時(shí)水解度達(dá)到最高；為了在相同前提條件下，能用較少酶量就可以達(dá)到最佳效果，所以選擇底物濃度[E]/[S]=10%為最佳水解條件。

2.3.2 不同溫度對堿性蛋白酶水解度的影響

由圖9可知，堿性蛋白酶在底物濃度[E]/[S]=10%，pH 9，僅以溫度為變量的單因素試驗(yàn)中，在1 h水解過程中，隨著溫度上升，水解度變化不明顯，在溫度35℃時(shí)水解度達(dá)到最高；所以水解溫度選擇35 ℃為堿性蛋白酶最佳的水解溫度，使得在相同前提條件下，使用較低溫度便可獲得較好水解效果，節(jié)約能源。

圖8 不同底物濃度下堿性蛋白酶的水解度

圖9 不同溫度下堿性蛋白酶的水解度

2.3.3 不同pH對堿性蛋白酶水解度的影響

由圖10可知，堿性蛋白酶的底物濃度[E]/[S]=10%，溫度45 ℃，僅以pH為變量的單因素試驗(yàn)中，在1 h水解過程中，隨著pH升高水解度呈現(xiàn)先快速升高再緩慢下降趨勢，并且pH 2時(shí)水解度達(dá)到最高；所以pH 2為堿性蛋白酶最佳水解pH，使得在相同前提條件下，選擇較低pH即可達(dá)到最佳的水解效果，水解條件也較為溫和。

圖10 不同pH下堿性蛋白酶的水解度

2.4 1 h內(nèi)胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解小米蛋白電泳分析

圖11 為1 h內(nèi)小米蛋白用胃蛋白酶水解。在pH 2，溫度35 ℃，底物濃度[E]/[S]=10%時(shí)，可以看到清晰的分子肽逐步消失的過程，最上端的亞基先被水解掉，分子量較大的肽段逐步消失，剩下較小的分子量的肽段。圖12為1 h內(nèi)小米蛋白用堿性蛋白酶水解。在pH 9，溫度45 ℃，底物濃度[E]/[S]=10%時(shí)，可以看到肽段逐步消失的過程，大分子量的肽段在該酶作用下極其容易水解，如果研究較大分子量肽段，不應(yīng)利用該種酶水解提取。采用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)，可將電荷和形狀對蛋白質(zhì)原的影響消除，使影響電泳結(jié)果的主要因素為蛋白質(zhì)分子量大小，小分子蛋白受到的阻力較小，因而遷移速率快，跑出的條帶位于下方；大分子蛋白受到的阻力較大，因而遷移速率慢，跑出的條帶位于上方。因此，在試驗(yàn)中采用該項(xiàng)技術(shù)，可展現(xiàn)小米蛋白在堿性蛋白酶和胃蛋白酶經(jīng)過不同條件的處理進(jìn)行水解后所形成的肽段分布；伴隨著水解過程進(jìn)行，小米蛋白在不同酶作用下逐步水解成肽段的動(dòng)態(tài)分布變化過程。

圖11 1 h內(nèi)胃蛋白酶水解小米蛋白電泳圖

圖12 1 h內(nèi)堿性蛋白酶水解小米蛋白電泳圖

3 結(jié)論

以小米蛋白粉為原料，使用胃蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，以鄰苯二甲醛法（OPA法）測定水解度，得到小米蛋白水解最佳時(shí)間為1 h，在此時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化小米蛋白粉在不同底物濃度、溫度和pH下胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解條件，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法觀察水解過程中肽段的變化，以制備出高水解度的小米蛋白。結(jié)果表明，采用胃蛋白酶水解濃度1%蛋白時(shí)，底物濃度[E]/[S]=10%，pH 2，溫度35 ℃水解1 h水解度最大；采用堿性蛋白酶水解濃度1%蛋白時(shí)，底物濃度[E]/[S]=10%，pH 9，溫度45 ℃水解1 h水解度最大；由聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可以看出肽段逐漸水解的過程，1 h內(nèi)小米蛋白用胃蛋白酶水解，在pH 2，溫度35 ℃，底物濃度[E]/[S]=10%時(shí)可以看到清晰的分子肽逐步消失，最上端亞基先被水解掉，分子量較大的肽段逐步消失，剩下較小的分子量的肽段；1 h內(nèi)小米蛋白用堿性蛋白酶水解，在pH 9，溫度45 ℃，底物濃度[E]/[S]=10%時(shí)可以看到肽段逐步消失，大分子量肽段在該酶作用下極容易被水解。