熱回流法提取甘草中甘草酸的工藝優(yōu)化及HPLC法測定含量

王振強，耿悅，王浩，婁軍暉

1. 黃河水利職業(yè)技術學院（開封 475003）；2. 天津科技大學食品工程與生物技術學院（天津 300457）；3. 旭梅（開封）生物科技有限公司（開封 475003）

甘草（Glycyrrhiza）又名甜草根，為豆科甘草屬多年生草本植物[1]，適宜生長于我國西北部和北部半干燥溫涼氣候區(qū)[2]。甘草為眾藥之王[3]，以根莖入藥，含有甘草酸（Glycyrrhizic acid）、甘草次酸（Glycyrrhetic acid）、甘草苷（Liquiritin）、甘草苷元（Glabrene）、甘草素等多種活性物質(zhì)[4]，味甘、性平，具有補脾益氣、止咳祛痰、消熱解毒、調(diào)和百藥等功效[5]。

甘草酸是從甘草根、莖中提取的一種有效活性成分，純品甘草酸為白色晶體，難溶于冷水，可溶于熱水，是非常珍貴的天然皂苷，具有抗氧化及促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）樣活性[6]。甘草酸及其系列產(chǎn)品，對肉瘤、癌細胞生長有抑制作用，對艾滋病的抑制率高達90%，有較強的增加人體免疫功能作用，而且也是很好的食品添加劑和香料基料[7]。近年來，甘草酸在醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)得到了廣泛的應用[8]，具有重要的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草，產(chǎn)自內(nèi)蒙古；甲醇、乙酸銨、冰乙酸、苯酚、硫酸、甲醇、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Modlel 525型高效液相色譜儀（天津市蘭博實驗儀器設備有限公司）；色譜柱C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：天津市蘭博實驗儀器設備有限公司；FA 1604 S電子分析天平（上海天平儀器廠）；DG 404型真空電熱干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）；LG 16-W型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；QL-901微型漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司）；RE-52 CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化設備儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

甘草經(jīng)室溫干燥后磨成粉末備用。

1.3.2 甘草酸提取單因素試驗

1.3.2.1 提取溫度對甘草酸提取的影響

準確稱取1.0 g甘草粉末，置于圓底燒瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸餾水，分別在50，60，70，80，90和100 ℃水浴下，熱回流提取0.5 h，提取5次，離心分離（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分別取2 mL置于試管中，于105 ℃烘干，將烘干后的樣品加入2 mL流動相，混勻，過濾，測定甘草酸得率。取10 μ L進行HPLC檢測，記錄峰面積。

1.3.2.2 料液比對提取效果的影響

準確稱取1.0 g甘草粉末，置于圓底燒瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，按料液比分別為1︰15，1︰20，1︰25，1︰30和1︰35（g/mL）分別加入蒸餾水，在90 ℃水浴下，熱回流提0.5 h，提取5次，離心分離（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分別取2 mL置于試管中，于105 ℃烘干，將烘干后的樣品加入2 mL流動相，混勻，過濾，測定甘草酸得率。取10 μL進行HPLC檢測，記錄峰面積。

1.3.2.3 提取時間對甘草酸提取的影響

準確稱取1.0 g甘草粉末，置于圓底燒瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸餾水，在90 ℃水浴下，分別熱回流提取0.5，1，1.5，2，2.5和3 h，離心分離（5 000 r/min，15 min），提取5次，浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分別取2 mL置于試管中，于105 ℃烘干，將烘干后的樣品加入2 mL流動相，混勻，過濾，測定甘草酸得率。取10 μL進行HPLC檢測，記錄峰面積。

1.3.2.4 提取次數(shù)對甘草酸提取的影響

準確稱取1.0 g甘草粉末，置于圓底燒瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸餾水，在90 ℃水浴下，分別熱回流提取2，3，4，5和6次，提取0.5 h，離心分離（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分別取2 mL置于試管中，于105 ℃烘干，將烘干后的樣品加入2 mL流動相，混勻，過濾，測定甘草酸得率。取10 μL進行HPLC檢測，記錄峰面積。

1.3.3 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)為因素水平，以甘草酸提取得率為試驗結果，設計L16(45)正交試驗，優(yōu)化甘草酸提取工藝條件。正交試驗條件因素水平見表1。

1.3.4 高效液相法測甘草酸含量

1.3.4.1 甘草酸提取得率計算[9]

式中：V表示樣品體積，mL；M表示由甘草酸銨標準曲線計算的樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；W表示甘草粉末質(zhì)量，g。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4.2 色譜條件

C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），理論板數(shù)按甘草酸峰計，3 500；流動相，甲醇-醋酸銨（0.2 mol/L）-冰乙酸（66︰33︰1）；流速，1.0 mL/min；檢測波長，250 nm；柱溫，25 ℃；進樣量，10 μL。

1.3.4.3 對照樣品溶液的制備

準確稱取12.1 mg甘草酸銨標準品（90%），加入10.0 mL流動相，制成1.21 mg/mL的溶液。

1.3.4.4 標準曲線繪制[10]

分別吸取0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mL對照樣品溶液，置于10 mL量瓶中，加流動相至刻度，按1.3.4.2小節(jié)各進樣10 μL，采用HPLC測定峰面積，以峰面積積分值為橫坐標，甘草酸銨的濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 甘草酸提取單因素試驗

2.1.1 提取溫度的確定

根據(jù)1.3.2.1小節(jié)進行試驗，提取溫度對甘草酸提取效果的影響如圖1所示。隨著提取溫度的升高，甘草酸提取得率逐漸增大，當溫度升至70 ℃時，再升高提取溫度，甘草酸提取得率開始逐漸降低。綜合分析，提取溫度為70 ℃比較合適。

圖1 提取溫度對甘草酸提取效果的影響

2.1.2 料液比的確定

根據(jù)1.3.2.2小節(jié)進行試驗，料液比對甘草酸提取效果的影響如圖2所示。隨著提取溶劑量的逐漸加大，甘草酸提取得率也緩慢增加；當料液比為1︰25（g/mL）時，再增加提取溶劑量，甘草酸提取得率顯著增大，考慮到提取溶劑加入過大，溶液太稀不利于甘草酸的提取，結合經(jīng)濟效益分析，料液比為1︰30（g/mL）比較合適。

圖2 料液比對甘草酸提取效果的影響

2.1.3 提取時間的確定

根據(jù)1.3.2.3小節(jié)進行試驗，提取時間對甘草酸提取效果的影響如圖3所示。隨著提取時間的增大，甘草酸提取得率逐漸增大，當提取時間增加到1 h時，再增加提取時間，甘草酸提取得率開始緩慢下降，這可能是甘草酸隨著時間的延長被破壞所致；另外，提取時間越長，耗能越大。綜合分析，提取時間為1 h比較合適。

圖3 提取時間對甘草酸提取效果的影響

2.1.4 提取次數(shù)的確定

根據(jù)1.3.2.4小節(jié)進行試驗，提取次數(shù)對甘草酸提取效果的影響如圖4所示。隨著提取次數(shù)的增加，甘草酸提取得率也逐漸增加，當提取次數(shù)達到5次時，再增大提取次數(shù)，甘草酸提取得率變化不大，這是因為甘草中甘草酸析出已接近最大值，繼續(xù)增加提取次數(shù)，對甘草酸提取影響很小。綜合分析，提取次數(shù)為5次比較合適。

2.2 正交試驗結果及方差分析

根據(jù)單因素試驗結果，設計L16(45)正交試驗，優(yōu)化甘草酸提取工藝條件。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2和表3結果可以看出，正交試驗優(yōu)化甘草酸提取工藝的最佳工藝條件為A4B4C1D4，即提取溫度90℃，料液比1︰30（g/mL），提取時間0.5 h，提取次數(shù)5次；各因素對提取效果的影響順序為A＞D＞B＞C，即提取溫度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間；提取溫度、料液比和提取次數(shù)均顯著影響甘草酸得率。在最佳提取工藝條件下進行驗證試驗，甘草酸得率為2.27%，與正交試驗結果理論值2.33%基本一致。

圖4 提取次數(shù)對甘草酸提取效果的影響

表2 正交試驗結果

2.3 高效液相法測定甘草酸含量標準曲線

根據(jù)1.3.4.4小節(jié)繪制甘草酸銨標準曲線，結果見圖5。甘草酸銨標準曲線的回歸方程為y=3×10-7x+0.012 8，R2=0.999 9，線性范圍為0.030 25～0.484 mg/mL。

圖5 甘草酸銨標準曲線

3 結論

在單因素試驗基礎上，正交試驗優(yōu)化甘草酸提取工藝的最佳提取條件為提取溫度90 ℃、料液比1︰30（g/mL）、提取時間0.5 h、提取次數(shù)5次；提取溫度、料液比和提取次數(shù)均顯著影響甘草酸得率；在最佳提取工藝條件下進行驗證試驗，甘草酸得率為2.27%，與正交試驗結果理論值2.33%基本一致。采用HPLC法測定甘草酸含量，標準曲線回歸方程為y=3×10-7x+0.012 8，R2=0.999 9，線性范圍為0.030 25～0.484 mg/mL。

該研究為甘草酸進行深加工綜合利用、開發(fā)系列產(chǎn)品提供理論參考依據(jù)。