RP-HPLC法測定植物油中苯并(a)芘殘留量

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

苯并(a)芘是一種常見的高活性間接致癌物和突變原，必須經細胞微粒體中的混合功能氧化酶激活才具有致癌性[1]。食品中苯并芘化合物主要來源于：熏烤或高溫烹調時使食品污染苯并芘；食品加工過程中被污染，如瀝青污染、包轉材料污染、環境污染等[2]。可通過改進食品加工方法，如熏制和烘烤食品時，改進燃燒過程，避免食品直接接觸炭火，改進熏煙工藝等措施降低污染[3]。試驗采用簡單二元流動相，以等度洗脫提高分離效能，試樣經正己烷提取，Cleanert BAP凈化，濃縮至干后經乙腈復溶，反相液相色譜分離，熒光檢測器檢測，建立了測定植物油中苯并芘的品質控制分析方法，并對市面上20個不同廠家植物油中苯并芘殘留量進行比較，旨在更好地控制植物油的內在品質，保證食用植物油的安全、優質。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

DGU-20A 3R高效液相色譜儀（帶RF-20A熒光檢測器，日本島津公司）；FA124電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；TG-16醫用離心機（四川蜀科儀器有限公司）；XH-D旋渦混合器（上海皓莊儀器有限公司）；JHD-002干式氮吹儀（上海極恒實業有限公司）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Cleanert BAP（500 mg/6 mL 30/pkg，Agela Technologies）。

1.2 材料與試劑

20批試樣（市售，包括10批次壓榨工藝植物油、10批次浸出工藝植物油，每批試樣均來自不同的生產廠家）；苯并(a)芘標準品（100 μ g/mL in Acetonitrile，98.8%，1 mL，Lot. 170317，0～8 ℃ and dark，BePure）；乙腈、二氯甲烷、正己烷、甲醇、無水乙醇均為色譜純（北京百靈威科技有限公司）；超純水（電阻率=18.2 MΩ·cm）。

2 方法與結果

2.1 色譜分離系統的確定

2.1.1 對照品儲備液的制備

精密吸取0.05 mL苯并(a)芘標準品，用乙腈定容到250 mL，避光保存在0～5 ℃的冰箱中，保存期1個月。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取0.4 g（精確到0.001 g）各廠家試樣，加入5 mL正己烷，漩渦混合0.5 min，在40 ℃下超聲提取10 min，以4 000 r/min離心5 min，轉移出上清液。加入5 mL正己烷重復提取1次。合并上清液，待凈化。將待凈化液轉移進Cleanert BAP（依次用5 mL二氯甲烷及5 mL正己烷活化柱子），待液面降至柱床時，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液。用6 mL二氯甲烷洗脫并收集凈化液到試管中。將凈化液在40 ℃下氮氣吹干，準確吸取2 mL乙腈，渦旋復溶0.5 min，過微孔濾膜后供液相色譜測定。同時做試樣空白試驗。

2.1.3 色譜條件和系統適應性試驗

采用Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相，乙腈-水（90︰10，V/V）；熒光檢測器：激發波長384 nm，發射波長406 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μ L。

取2.1.1的對照品溶液，在2.1.3的色譜條件下進行分析。苯并(a)芘拖尾因子為0.96，理論塔板數（USP）為19 692。

2.1.4 方法專屬性試驗

苯并(a)芘標準溶液、陰性試樣溶液及典型陽性試樣溶液色譜圖見圖1～圖3。結果表明，方法專屬性好，選擇性高。

2.2 分析方法驗證

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限考察

分別精密吸取0，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 μL 2.1.1的對照品溶液，注入液相色譜儀，在2.1.3的條件下測定，得到峰面積與質量濃度的線性關系，擬合回歸方程式，確定相關系數、最低檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），詳見表1。結果表明，苯并(a)芘在0～19.76 ng/mL范圍內線性關系良好，完全能滿足植物油中其殘留量的測定。

2.2.2 精密度考察

取2.2.1的苯并(a)芘線性第4點對照品溶液，按2.1.3的色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。以峰面積計算RSD（n=6），為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 方法重復性考察

取編號為1-1植物油試樣，按2.1.2的方法制備6份供試品溶液進行色譜分析，計算殘留量。苯并(a)芘殘留量RSD值為0.37%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 溶液穩定性考察

取制備好的編號為1-1植物油供試品溶液，按2.1.3的儀器條件分別于0，4，8，12，16和24 h進樣測定，記錄色譜峰面積，計算苯并(a)芘RSD（n=6），為0.41%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 耐用性考察

取2.2.1的線性第4點對照品溶液，分別考察采用不同柱溫（34，35和36 ℃），以及不同流速（0.9，1.0和1.1 mL/min）進行測定時儀器色譜行為的變化。以峰面積計，不同柱溫條件下苯并(a)芘RSD（n=3）為0.58%；不同流速條件下苯并(a)芘RSD（n=3）為0.71%。表明在實際應用過程中色譜條件有微小變化時，植物油中苯并(a)芘殘留量測定條件較寬，測定結果不受影響，系統具有較好的耐用性。

2.2.6 回收率考察

精密稱取已測定含量的試樣（編號1-1），平行9份，置于50 mL離心管中，加入適量苯并(a)芘對照品儲備液，后按2.1.2和2.1.3的條件操作，結果見表2。苯并(a)芘的平均回收率為100.25%，RSD為0.62%，表明該方法具有良好回收率，準確度符合要求。

圖1 苯并(a)芘標準色譜圖

圖2 陰性試樣色譜圖

圖3 典型陽性試樣色譜圖

表1 回歸方程、相關系數、最低檢出限、定量限

表2 回收率試驗結果

2.3 樣品含量測定

取20批不同廠家的植物油試樣，各3份，按2.1.2的方法制備供試品溶液，在2.1.3的色譜條件下測定，采用外標法以峰面積計算含量，結果見表3。

表3 試樣含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

參考文獻[4-6]苯并(a)芘殘留量測定方法中供試品溶液的制備方法，考察正己烷、乙腈、甲醇、無水乙醇對苯并(a)芘提取能力的影響，發現分2次用正己烷超聲處理10 min，可將樣品提取完全。

3.2 流動相的選擇

經查閱參考文獻[7-9]，最終選擇乙腈-水溶液（90+10）等度洗脫，可有效縮短分析時間，保證峰形良好，適用于苯并(a)芘的大批量檢測和應急檢測。

3.3 含量分析

測定了20個不同生產廠家的試樣，苯并(a)芘含量為0.214 7～2.883 6 μg/kg，測定結果均符合GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》[10]。通過比較各組分含量測定結果，發現不同廠家間存在明顯差異，其原因可能與原輔料的選取和生產工藝的控制有關。因此，食品生產者應嚴把原輔料進廠關，全面規范并提高生產工藝關鍵控制點及品質標準，杜絕勾兌現象，確保食品的安全、健康，從而更好地維護消費者舌尖上的安全。

4 結論

試驗建立了植物油中苯并(a)芘殘留量的RP-HPLC檢測方法。該方法分離提取效果好，靈敏度、準確性高，重復性佳。可有效滿足檢驗檢測機構對植物油中苯并(a)芘殘留量的測定。