分散固相萃取-HPLC-MS/MS法測定熱帶水果中4-氯苯氧乙酸

候德莉，梁振綱*，陳文慧，王玉健，尹志兵

1. 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心（海口 570311）；2. 海南大學材料與化工學院（海口 570228）

4-氯苯氧乙酸又稱防落素、促生靈、番茄靈等，是一種內吸、廣譜、高效的酚類植物生長調節劑，由植物的根、莖、葉、花、果吸收進入植物體內[1]，能防止作物落花落果、促進果實發育、形成無籽果實、提早成熟、增加產量、改善品質等[2-3]。隨著4-氯苯氧乙酸應用范圍的不斷擴大，其在人體內的殘留和累積可能帶來健康隱患。已有研究表明，4-氯苯氧乙酸對小鼠的肝臟、腎臟以及成熟精細胞具有毒性作用[4-6]。因此，有必要建立準確、快速、高效的4-氯苯氧乙酸殘留檢測方法。目前，檢測4-氯苯氧乙酸的方法有離子色譜法[7]、氣相色譜法[8-9]、氣質聯用色譜法[10-11]、液相色譜法[12-14]以及液質聯用色譜法[15-18]。液質聯用色譜法靈敏度高、定性準確，能夠有效排除雜質干擾，是目前4-氯苯氧乙酸殘留分析的主要手段。但現有文獻前處理多為固相萃取[19-20]、液-液萃取[21-22]等，耗時長且成本高。分散固相萃取技術利用吸附劑與基質中的雜質相互作用而達到除雜凈化的目的，具有快速、簡便、低成本、環境友好等優勢。因此，試驗采取分散固相萃取凈化，高效液相色譜串聯三重四級桿質譜檢測，建立了以石墨化碳黑為分散萃取劑測定熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的檢測方法。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸（色譜純，美國TEDIA公司）；石墨化碳黑凈化劑（美國Agilent公司）；微孔濾膜（0.22 μm，有機系）；4-氯苯氧乙酸標準品（純度≥99.0%，購自天津阿爾塔科技有限公司）。

標準溶液：用乙腈配制成1 000 μg/mL標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；API 4000 Q四極桿質譜儀（美國ABI公司）；配有電噴霧離子源；Harvard II針泵（美國Varian公司）；MS3 Basic旋渦混勻器（廣州IKA公司）；Centrifuge 5810 R離心機（Eppendorf公司）；G-285電子天平（Mettler公司）。

1.3 前處理方法

準確稱取5 g（精確至0.01 g）粉碎均質后的水果樣品至50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，加入5 g無水硫酸鈉，渦旋混合1 min，以4 000 r/min離心10 min，分取1 mL至玻璃試管中，加入100 mg GCB吸附劑，渦旋混合30 s后，以4 000 r/min離心3 min，取上清液，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore RP-MS（3 mm×150 mm，2.6 μm）。流速：0.6 mL/min。柱溫：40 ℃。進樣量：10 μL。流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.5 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負離子掃描；多反應監測（MRM）模式；離子源溫度600 ℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣。將4-氯苯氧乙酸標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子；通過優化條件，得到二級質譜圖。根據二級質譜圖，推斷4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式，如圖1所示。

圖1 4-氯苯氧乙酸可能的斷裂方式

通過MRM選擇相對豐度較高的離子對，確定為定性定量離子對，并優化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數。優化后的質譜條件見表2。

表2 MRM模式下4-氯苯氧乙酸的掃描參數

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

4-氯苯氧乙酸為酚酸化合物，易溶于甲醇、乙腈、丙酮和苯。乙腈作為一種通用的提取溶劑，以其對蛋白質、糖類和脂肪難提取，能有效消除基質效應影響的優勢，在殘留檢測中得到廣泛應用[23-24]。由于4-氯苯氧乙酸為羧酸化合物，提取體系的pH會影響其在水相和乙腈相之間的分配平衡[25]，試驗對比了乙腈和1%乙酸-乙腈兩種提取溶劑，結果表明，選用含有1%乙酸-乙腈作為提取溶劑，其平均回收率顯著提高。因此選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

熱帶水果樣品基質復雜，含有大量的糖分和有機酸類化合物，在未凈化處理時有基質增強效應。試驗比較了PSA、Florisil、中性氧化鋁（AL-N）、C18、C8和GCB等凈化方式。其中，加入PSA、Florisil和AL-N后回收率低，原因可能是PSA、Florisil對極性化合物有吸附作用，尤其是PSA對有機酸、酚類的吸附作用強，在凈化過程中同時吸附目標化合物，而中性氧化鋁（AL-N）的表面是電中性的，容易保留芳香族等富電化合物，也是造成回收率低的原因之一；C18、C8在不同程度上對樣品中的色素有吸附作用，加入提取液后溶液明顯澄清，但是結果表明，加入后基質增強效應沒有減弱，回收率偏高。GCB常用于蔬菜、水果、茶葉中農藥殘留分析中的樣品凈化，能有效去除平面分子。試驗表明，采用GCB作為凈化劑，回收率穩定且符合殘留分析要求。不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時的回收情況見圖2。

圖2 不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg時的回收率范圍

2.3 流動相選擇

分別考察了甲酸-水體系、乙酸銨-水體系、甲酸-乙酸銨-水體系對峰形、響應值等影響。結果表明，乙酸銨對待測組分有抑制作用，流動相加入乙酸銨后，響應值降低；使用甲醇-甲酸水作為流動相時，色譜柱壓力較大，洗脫能力弱，響應值僅為乙腈-甲酸水體系的50%。所以選用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。4-氯苯氧乙酸標樣MRM色譜圖見圖3。

2.4 基質效應、線性關系及檢出限

基質效應是指在提取基質中的目標化合物時，樣品基質中的某些共提取物組分影響目標化合物的離子化，對待測物濃度或質量的測定準確度產生影響，使得目標化合物在儀器上的響應發生增強或者抑制的現象。試驗采用相對響應值法[26]考察4-氯苯氧乙酸在7種熱帶水果中的基質效應。結果顯示，進行6平行測試，4-氯苯氧乙酸的基質效應值均在8%～100%之間，基質效應可忽略不計。

配制質量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL一系列標準曲線，并依次進樣，以目標化合物的濃度X為橫坐標、相應的峰面積Y為縱坐標，作標準曲線。結果表明，4-氯苯氧乙酸在0.5～50.0 ng/mL范圍內有良好的線性關系，線性方程及相關系數見表3。以實際檢測時的信噪比（RSN）為3作為檢出限，信噪比（RSN）為10作為定量限，該方法的檢出限（LOD）為0.3 μg/kg，定量限（LOQ）為1.0 μ g/kg。

圖3 多反應監測模式下4-氯苯氧乙酸的標準色譜圖

表3 4-氯苯氧乙酸的線性方程和相關系數

2.5 回收率與精密度試驗

以荔枝、紅毛丹、番石榴、圣女果、菠蘿、木瓜、芒果樣品作為基質，分別對其添加低、中、高三個水平的4-氯苯氧乙酸，每個添加濃度做6個平行試驗，用于考察該方法的回收率和精密度，方法的平均回收率在81.0%～109.4%之間，RSD在2.7%～6.7%之間，結果見表4。7種基質陰性樣品和標準添加樣品的MRM色譜圖見圖4。

表4 7種熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的平均回收率和相對標準偏差（n=6）

圖4 多反應監測模式下7種熱帶水果陰性樣品和標準添加樣品色譜圖

3 實際樣品檢測

對近兩年海南省156批次出口水果樣品進行檢測，2個鮮荔枝樣品、1個芒果樣品檢出4-氯苯氧乙酸，檢出值分別為33.0，16.0和6.28 μg/kg，檢出率為1.92%，其中一個荔枝樣品超出日本肯定列表的規定。

4 結論

試驗通過對前處理方法中的提取溶劑、凈化條件、流動相以及對儀器的色譜和質譜條件進行優化，建立了熱帶水果中4-氯苯氧乙酸的液相色譜-質譜/質譜檢測方法。結果表明，在1.0，10.0和100.0 μg/kg三個添加水平下，回收率范圍為81.0%～109.4%，相對標準偏差為2.7%～6.7%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》要求。該方法快速簡便，定量準確，檢出限能達到0.3 μg/kg，能夠滿足日本肯定列表對熱帶水果中4-氯苯氧乙酸0.02 mg/kg的限量要求。