Tim-3抗腫瘤免疫的研究進展①

董 頔 陳志芳

(新疆醫科大學第一附屬醫院,烏魯木齊 830054)

免疫細胞和分子是腫瘤生物學的關鍵調節點，具有支持或抑制腫瘤發展、生長、侵襲和轉移的能力。腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細胞通過多種機制逃避機體免疫系統識別和攻擊，從而得以在體內生存和增殖的現象[1]。近年來，針對腫瘤免疫逃逸機制進行的癌癥免疫療法取得了令人矚目的臨床效果[2，3]。程序性死亡受體(programmed cell death protein 1，PD-1)作為免疫抑制分子，在腫瘤免疫逃逸機制中發揮著重要作用[4]。盡管針對PD-1的檢查點阻斷策略取得了成功，但大部分癌癥患者尚未從這種新療法中獲益[5]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)已被發現在傳染病、自身免疫疾病和腫瘤小鼠模型中介導免疫耐受[6-8]。Tim-3作為癌癥免疫療法的潛在候選因子已經獲得突出地位，并且已經證明Tim-3與其他檢查點抑制劑的體內阻斷增強了抗腫瘤免疫力并抑制了幾種臨床前腫瘤模型中的腫瘤生長[8-10]。

1 Tim-3的分子結構

Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)在人和小鼠的多種免疫細胞類型中表達。小鼠的Tim-3由281個氨基酸殘基組成，而其人類同源物由302個氨基酸殘基組成，與小鼠Tim-3具有63%的同源性[11]。Tim-3屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)，包括膜遠端免疫球蛋白(IgV)結構域、胞漿區、跨膜區、黏蛋白區和信號肽區。其中胞漿區主要功能是參與信號傳遞，決定下游信號通路的傳導，IgV結構域與適當配體的結合對于Tim-3的免疫調節具有重要作用，有助于誘導外周耐受和抑制抗腫瘤免疫[12]。與跨膜結構域相鄰的Tim-3細胞質尾部含有5個酪氨酸殘基的保守區域，其中兩個對于偶聯到下游信號傳導途徑至關重要[13]。這兩個酪氨酸殘基的肽序列在人和小鼠之間高度保守，并且作為SH2結構域結合基序起作用。含SH2結構域的激酶許多是T細胞受體(T cell receptor，TCR)信號通路的關鍵組成部分，說明Tim-3和TCR通路之間存在功能關系[14]。

2 Tim-3的配體

2.1Galectin-9 關于Tim-3配體，最初鑒定了兩種細胞膜外相關蛋白，其分子量分別約為35 kD和60 kD，并與Tim-3IgV結構域結合。分子量為35 kD的細胞膜外相關蛋白在生物化學上被表征為C型凝集素Galectin-9[15]。Galectin-9是一種含有兩個串聯碳水化合物識別結構域的可溶性蛋白質，特異性識別Tim-3 IgV結構域中N-連接糖鏈的結構，但不識別Tim-2和Tim-4等Tim家族蛋白質[16]。與Tim-3 IgV結構域和其他半乳糖凝集素(包括半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-4)的相互作用相比，Tim-3IgV結構域和Galectin-9之間的結合具有最高親和力，表明Galectin-9和Tim-3之間存在特異性結合的相互作用[17]。Galectin-9和Tim-3之間的相互作用引發Th1細胞死亡，從而抑制組織產生炎癥反應，減少自身免疫疾病的發生[18]。相同的，Galectin-9還誘導結腸癌Tim-3+CD8+TIL的凋亡[19]。然而，因為Galectin-9被發現可增加Tim-3介導的NK細胞系中IFN-γ的產生，所以并非所有Galectin-9-Tim-3相互作用都會導致細胞死亡[20]。在人類THP-1骨髓細胞中，Galectin-9激活Tim-3介導的PI3KmTOR信號傳導通路而不誘導細胞凋亡[21]。

Galectin-9和Tim-3在單核細胞/巨噬細胞上的相互作用可能會導致細胞因子的產生改變，其通過改變IL-12和IL-23的產生從而影響Th1或Th17的應答[22]。

Tim-3與Galectin-9之間存在反向作用。小鼠結核病模型的研究表明，Tim-3通過小鼠和人類細胞中Galectin-9依賴性機制，對誘導IL-1β的產生和增強巨噬細胞中的抗分枝桿菌活性非常重要[23]。研究發現，Tim-3 T細胞轉基因CD4+T細胞控制Galectin-9陽性的巨噬細胞中的結核分枝桿菌復制，進一步證實了Tim-3-Galectin-9反式相互作用介導的負性信號對于巨噬細胞中的抗結核分枝桿菌活性至關重要[24]。這種負性信號通路在控制感染者的結核分枝桿菌生長方面起著重要作用，這些人T細胞上Tim-3的表達會增加。總的來說，Tim-3反向作用于Galectin-9，使Th1和Tc1控制細胞內病原體來清除被感染的巨噬細胞[25]。IFN-γ誘導Galectin-9表達可促進巨噬細胞內病原體的清除，同時確保T細胞上的Tim-3分子不會對Th1細胞應答產生克隆增殖[26]。

2.2Ceacam1 第二個被發現的Tim-3配體是癌胚抗原細胞黏附分子1(Ceacam1)，其分子量約為60 kD[27]。Ceacam1膜遠端Ig V區是一種高度保守的結構，與Tim-3的Ig V區具有結構相似性，并且沿著它們的FG環相互作用，研究者們推測這就是配體的結合位點[28]。當Ceacam1過表達時，可以顯著增強 Tim-3 分子的負性免疫調控功能，并且在沒有Ceacam1表達的情況下Tim-3的抑制功能會被削弱[27]。此外，Ceacam1-Tim-3反式相互作用會抑制效應T細胞功能，并且對維持T細胞耐受是必需的[29]。Galectin-9和Ceacam1分別與Tim-3的Ig V區中的不同區域結合，均會導致細胞質尾部釋放Tim-3信號通路抑制性調節劑Bat3這樣的下游效應發生[30]。因此，這兩種配體可能在調節Tim-3信號傳導中具有協同作用。

2.3HMGB1 高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)作為Tim-3配體，是一種與損傷相關的分子模式蛋白，可以感知內源性危險信號[31]。HMGB1可以從活化的樹突狀細胞主動釋放，以促進T細胞和B細胞的反應。在樹突狀細胞中，HMGB1在核酸轉運到內體囊泡過程中起關鍵作用，這是樹突狀細胞感知腫瘤衍生的應激因子或病原體相關的分子模式的關鍵步驟，并產生對腫瘤或病原體感染的保護性免疫反應[32]。在腫瘤微環境中，腫瘤浸潤性樹突狀細胞中Tim-3表達水平高于正常組織樹突狀細胞中Tim-3的表達水平。Tim-3與HMGB1結合以阻斷核酸向內體的轉運，從而抑制模式識別受體介導的對腫瘤衍生核酸的先天免疫應答[33]。因此，阻斷Tim-3介導的核酸感應系統的抑制作用可能會有助于DNA疫苗的開發和化療用藥的進展。有趣的是，Tim-3上的HMGB1結合表位與Tim-3上的Ceacam1結合表位大部分重疊，FG環中的Q62(人類E62)是與HMGB1和Ceacam1相互作用的必需氨基酸殘基，由此衍生出了HMGB1和Ceacam1之間潛在競爭性結合Tim-3的問題[34]。

2.4PtdSer 磷脂酰絲氨酸(PtdSer)是Tim-3的非蛋白質配體，與Tim-3 IgV結構域的FG-CC′環結合。 由于FG-CC′環形成的裂縫是所有Tim蛋白共有的特征結構，因此PtdSer也是Tim家族其他蛋白的配體[35,36]。PtdSer與Tim蛋白的結合與凋亡細胞的清除有關[37]。因為T細胞沒有清除凋亡小體的作用，所以T細胞中Tim-3-PtdSer的相互作用目前尚不清楚[38]。然而，IL-10與Tim-3陽性的T細胞共表達，所以Tim-3與PtdSer的相互作用可能誘導T細胞產生IL-10。

由于Tim-3 IgV結構域中FG-CC′環存在重疊的結合位點，因此了解Ceacam1、HMGB1和PtdSer如何協調它們與Tim-3的相互作用并調節特異性免疫是非常重要的。

3 Tim-3與腫瘤

3.1Tim-3生物學特性與癌癥的關系 Tim-3除了在免疫細胞和腫瘤中的表達升高外，它的遺傳多態性也與癌癥有關。在中國人的啟動子區域(-574G/T，-882C/T，-1516G/T和-1541C/T)和編碼區域內鑒定出Tim-3基因的多態性(+4259T/G，氨基酸取代物：精氨酸替換亮氨酸)[39]。攜帶+4259TG基因型的受試者與對照組相比，患非小細胞肺癌的風險增加2.81倍，且存活時間明顯縮短[40]。攜帶+4259 TG基因型和+4259G等位基因的受試者與對照組相比，胰腺癌患病率顯著增加[41]。

3.2Tim-3與癌癥預后 多種腫瘤的癌細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TILs)和內皮細胞中均已發現Tim-3的表達[42]。已有充分證據表明，在腫瘤組織樣本Tim-3的蛋白水平和mRNA表達水平均升高，并且與前列腺癌、腎透明細胞癌、結腸癌、膀胱尿路上皮癌和宮頸癌患者的預后不良有關[19,43-46]。腫瘤抗原特異性CD8+T細胞中Tim-3表達增加也與CD8+T細胞功能障礙和HBV相關肝細胞癌和前列腺癌患者預后不良有關[43,47]。同樣，胃癌患者NK細胞Tim-3表達增加與腫瘤進展有關[4]。因此，人類免疫細胞中Tim-3的表達增加可作為各種腫瘤的潛在預后生物標志物。

3.3Tim-3參與腫瘤T細胞的調節 在不同癌癥中進行的研究最終證實Tim-3由于其與腫瘤T細胞耗竭有關而充當抗腫瘤免疫的負調節劑。在晚期黑色素瘤的患者中，有腫瘤-睪丸抗原家族NY-ESO-1抗原特異性表達的Tim-3+PD-1+CD8+T是腫瘤誘導的T細胞中功能高度失調的一種細胞，并且約30%的NYESO-1特異性CD8+T細胞表達Tim-3[48]。同樣的，在非小細胞肺癌患者中，近33%的CD8+TILs表達Tim-3[35]。在這些癌癥中，Tim-3+T細胞共同表達PD-1并表現出增殖功能和效應細胞因子產生的不足。

最近的研究證明了Tim-3除了具有調節癌癥CD8+T細胞效應功能，還在調節人Tim-3+Foxp3+Treg細胞中起到關鍵作用，肝細胞癌，卵巢癌，結腸癌和宮頸癌中均有Tim-3+Foxp3+Treg細胞的存在[19,46,47,49]。在非小細胞肺癌患者中，約60%的CD4+Foxp3+TILs中表達Tim-3[35]。TILs中Tim-3+Foxp3+Treg細胞的存在與腫瘤淋巴結轉移和晚期癌癥有關。由于多種臨床模型腫瘤組織中發現Tim-3+Foxp3+Treg細胞的存在，進一步證實了Tim-3在Foxp3+Treg細胞中的作用[50]。可能是由于IL-10的表達增加，這些模型中的腫瘤組織表達了比Tim-3-Foxp3+Treg細胞更具免疫抑制性的Tim-3+Foxp3+Treg細胞。在這些模型中，Tim-3+Foxp3+Treg細胞被認為促進了CD8+TIL功能失調。另一種假設表明腫瘤微環境驅動了Foxp3+Treg細胞活化，并且Tim-3表達增加導致了更嚴重的腫瘤浸潤性CD8+T細胞的免疫抑制。

3.4Tim-3調節腫瘤固有免疫細胞 與Tim-3在T細胞上的可誘導性表達相比，在固有免疫細胞上發現了Tim-3的成組性表達。到目前為止進行的大多數體內研究已經確定Tim-3在抗腫瘤固有免疫中起抑制作用[51]。

Tim-3已經被證實在人單核細胞中具有直接抑制作用[52]。它在未刺激的外周血CD14+單核細胞上呈成組性表達，但TLR刺激后，伴隨IL-12產生的增加，Tim-3表達水平迅速下降。在通過TLR4/7刺激后，阻斷Tim-3會導致單核細胞中IL-12和IL-10的增加。

最近的一項研究表明，Tim-3在肝細胞癌腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM)的表達是由包括TGF-β在內的腫瘤衍生信號誘導的[53]。由于可溶性因子如IL-6的分泌，進一步促進了TAM介導的肝細胞癌生長。此外，Tim-3的表達抑制了該模型中腫瘤特異性CD8+T細胞的活化。最近的研究表明M1巨噬細胞具有吞噬、呈遞抗原和促炎癥細胞因子產生等多種功能，并有助于消除具有Tim-3低表達的癌細胞[54]。這證明了Tim-3在多種細胞類型中的起免疫抑制作用及其在腫瘤微環境中具有調節免疫細胞相互作用的功能。

3.5Tim-3和腫瘤細胞 越來越多的證據表明，Tim-3的表達不僅限于免疫細胞，也在癌細胞上表達，如黑色素瘤、骨肉瘤、宮頸癌和腎透明細胞癌[44，48,55]。最近的兩項研究表明，Tim-3在急性髓性白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)中高表達， 但不在正常的造血干細胞(hemopoietic stem cells，HSCs)中表達[56，57]。 由于急性髓性白血病患者同時含有LSCs和HSC，因此Tim-3可作為LSC的標志物監測急性髓性白血病干細胞的產生。此外，還在淋巴瘤上皮細胞上發現了Tim-3的表達。

Tim-3在多種腫瘤細胞中的表達說明了其在腫瘤進展中的潛在作用。研究表明Tim-3可通過不同的機制促進腫瘤進展，包括促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，通過激活IL-6-STAT3途徑直接抑制CD4+T細胞以抑制Th1極化，或激活AML細胞中的mTOR功能[58]。

由于Tim-3-Galectin-9負性信號通路對于骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)增殖至關重要， Tim-3在腫瘤細胞上的表達與其在TILs上的表達相似[59]。通過Galectin-9依賴機制形成MDSCs的免疫抑制功能從而在腫瘤免疫逃避中發揮重要作用。因此，需要進一步研究以更好地了解Tim-3介導的免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用。

4 展望

越來越多的證據支持Tim-3與人類癌癥相關。無論是在實驗模型還是在人體中，現在已經確定，Tim-3和PD-1標記多種癌癥的功能失調T細胞。此外，在效應T細胞、Treg細胞和固有免疫細胞等多種細胞類型中觀察到Tim-3的免疫抑制作用,并且由于Tim-3也在非T細胞中表達，阻斷Tim-3可能將腫瘤微環境從免疫抑制狀態轉變為免疫激活或抗腫瘤狀態,以上發現強調了在這些細胞中靶向Tim-3的重要性。由于Tim-3不僅在CD8+T細胞和Foxp3+Treg細胞這兩個關鍵的促腫瘤免疫抑制的免疫細胞上表達，并且在骨髓細胞、NK細胞、癌癥干細胞和癌細胞本身也有表達，而且Tim-3與免疫抑制和腫瘤促進作用相關，所以Tim-3是抗癌免疫治療的一個非常合適的靶向目標。

目前的實驗結果說明阻斷Tim-3可以提高細胞介導的抗腫瘤免疫反應。此外，Tim-3單克隆抗體可能與其他免疫治療方式共同作用來增加抗腫瘤治療的功效。徹底了解Tim-3在各種腫瘤和腫瘤免疫治療模型中的不同作用，有利于進一步靶向Tim-3的藥物開發和設計與PD-1或CTLA-4單克隆抗體的組合療法。