miR-618靶向SOCS1對肝癌患者中樹突狀細胞表型及功能的調控機制

張壯苗 張 巖

(三亞市人民醫院血液腫瘤科，三亞 572000)

肝癌為當前最常見的惡性腫瘤之一，該病起病隱匿、術后易復發且對放化療敏感性均較差，總體治療效果仍有待提高[1]。近年來生物免疫治療在癌癥治療中的作用被逐漸發現，樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前已知的最強大的抗原提呈細胞，其能夠有效激活靜息期T細胞，同時促進患者免疫功能的恢復、提高抗腫瘤能力，已成為腫瘤免疫治療的熱點[2]。

細胞因子信號轉導抑制因子-1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)經研究證實能夠對多種細胞因子進行調節，同時與DC分化、T細胞功能以及腫瘤的發生和進展存在關聯[3]。有研究證實SOCS1沉默能夠促進DC抗原提呈、增強細胞免疫功能并且促進IFN-γ以及TNF-α的分泌水平[4]。同時，SOCS1拮抗物能夠顯著增強樹突狀細胞的抗腫瘤能力[5]。越來越多的研究表明miRNA以及基因在DC的發育、分化以及功能調控發揮重要作用[6]。如有研究發現miR-146a能夠靶向CD40L基因進而調控氧化修飾低密度脂蛋白刺激的DC的成熟以及炎癥因子的分泌[7]。此外也有研究證實抑制miR-148a能夠調節DC以及T細胞，可作為一種新的抗癌免疫治療的手段[8]。miR-618經研究證實在甲狀腺癌以及前列腺癌中發揮抑癌因子的作用[9,10]，但是其在肝癌的發病中是否發揮作用尚未明確，我們通過生物信息學在線預測網站發現miR-618與SOCS1存在結合位點，因此選定miR-618作為SOCS1的靶向miRNA，旨在進一步探討其是否能夠影響肝癌DC免疫調控功能，同時探討其具體調控機制，希望為肝癌的免疫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；LipofectamineTM3000試劑盒、RPMI1640培養基、Gibco Opti-MEM培養基和NanoDrop-1000購自賽默飛世爾公司；pmirGLO質粒購自ADDgene公司；質粒提取試劑盒Sigma、雙熒光素酶試劑盒購自Promega公司；TransScriptⅡ Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒購自全式金公司；TNF-γ、IL-6和IFN-α ELISA試劑盒購自齊一生物科技(上海)有限公司；所有抗體均購自Abcam公司；HEK-293T細胞購自武漢普諾賽公司；TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司；CytoFLEX流式細胞儀和UniCel DxI800全自動免疫分析系統購自貝克曼庫爾特公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；所有序列均由華大基因合成。

1.2方法

1.2.1DC誘導分離 采集我院58例肝癌患者外周血，通過淋巴細胞分離液離心得到外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，培養于RPMI1640全培基中(RPMI1640+10%胎牛血清+2 mmol/L-谷氨酰胺+100 U/ml 青霉素+100 μg/ml 鏈霉素+1 g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸鈉+5×105mol/L的巰基乙醇)。待培養至第3天換液，吸去原培養液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鮮RPMI1640培養液和適量肝癌細胞裂解液作為抗原刺激物，置CO2孵箱中培養。培養7 d左右使其分化成DC，但并未成熟。此時輕輕吸去含有IL-4和GM-CSF的RPMI1640培養液，更換等量的含有IFN-α的RPMI1640培養液，繼續置于5%CO2孵箱中37℃培養，至第9天時可獲得成熟的DC。

1.2.2T細胞分離 取PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液將細胞配成2×107個/0.5 ml。融化凍存的尼龍毛柱，以5～7滴/min的速度放出Hanks液。用5 ml預溫至37℃的細胞培養液洗滌尼龍毛柱。將0.5 ml的PBMC懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2 ml細胞培養液，夾住塑料管。在37℃、5%CO2飽和水汽CO2培養箱中培養1 h，使細胞與尼龍毛充分黏附。用5 ml預溫至37℃的細胞培養液洗脫尼龍毛柱。洗脫液中含有純的T細胞。收集洗脫液并于2 230 r/min 轉速下離心10 min，去上清，進行常規培養。

1.2.3DC細胞及T細胞表面標志物檢測 用適量的培養基重懸細胞，調整其濃度為2×106個/ml。DC細胞表面標志物檢測：在每個流式細胞管中加入50 μl稀釋后的CD83-FITC或CD1a-PE。T細胞表面標志物檢測：在每個流式細胞管中加入50 μl稀釋后的CD3-APC、CD4-FITC或CD8-PE。隨后在各管中加入50 μl細胞(約4×107個細胞)，輕輕混勻后避光冰浴20 min。隨后于4℃下2 000 r/min離心 10 min，棄去上清，在細胞沉淀中加入500 μl PBS緩沖液輕輕吹洗，再置于4℃下2 000 r/min離心10 min，此步驟重復2次。最后400 μl PBS懸浮細胞沉淀上機檢測。Cellquest分析流式結果。

1.2.4雙熒光素酶報告系統鑒定miR-618與SOCS1靶向關系 設計SOCS1的野生型及定點突變的3′UTR 片段并交由華大基因合成，隨后分別克隆到含有熒光素酶報告基因pmirGLO上游。挑菌、測序后提純質粒備用。miR-618 mimic和陰性對照序列(由賽默飛世爾合成)分別與野生型及突變型3′UTR片段按LipofectamineTM3000說明書兩兩共轉染至HEK-293T細胞。轉染后4 h換液，在37℃、5%CO2的培養箱中培養48 h后，收獲細胞。雙熒光素酶試劑盒和全自動化學發光儀檢測細胞相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.5細胞分組及轉染 將DC分為如下幾組：mimic NC組(細胞轉染含mimic NC脂質體)、miR-618 mimic組(細胞轉染含miR-618 mimic脂質體)、sh-SOCS1組(細胞轉染含SOCS1 shRNA質粒的脂質體)、sh-NC組(細胞轉染含shRNA NC質粒的脂質體)、miR-618 mimic+sh-SOCS1組(細胞共轉染含SOCS1 shRNA和miR-618 mimic的脂質體)，轉染和細胞培養步驟依據lipofectamin 3000說明書進行。

1.2.6熒光定量PCR檢測DC中miR-618表達 按TRIzol試劑盒提取DC中總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，使用ND-1000測量260 nm和280 nm 下吸光值，對總RNA的質量進行鑒定及測定濃度。利用TransScript Ⅱ Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒一步完成RT-PCR合成及qPCR。反應體系和反應條件均依據試劑盒說明書進行。使用實時熒光定量PCR儀進行擴增，測定miR-618表達水平(上游引物：5′-GGGGAAACTCTA-CTTGTCCTT-3′,下游引物：5′-TCGTATCCAGTGC-GTGTCGT-3′)，相對表達水平以U6為內參(上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTTGCGTGTCAT-3′)，引物序列由華大基因合成。采用溶解曲線評價PCR結果的可靠性，2-ΔΔCt法計算miR-618表達量。

1.2.7Western blot檢測SOCS1蛋白表達 RIPA裂解液使用前5min加入PMSF，使PMSF終濃度為1 mmol/L。棄去細胞培養基，PBS洗滌細胞2次，將適當的RIPA裂解液加入DC中(2×107細胞中加入1 ml裂解液)并于冰上孵育5 min。裂解物于12 000 g、4℃下離心5 min。BCA試劑盒測定蛋白濃度并用去離子水調整，隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上。含5%牛血清蛋白的TBST在搖床上室溫封閉1 h。棄去封閉液，加入鼠一抗SOCS1。GAPDH作為內參。轉膜后置于4℃冰箱過夜。次日，用TBST漂洗，加入稀釋后的山羊抗鼠IgG二抗，4℃孵育4～6 h后，TBST洗膜。PVDF膜與ECL液在室溫下反應1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片，觀察結果。以目標條帶與內參照條帶的灰度值之比作為蛋白質的相對表達量。

1.2.8DC活化表面抗原檢測 于Falcon管中加入CD11c-FITC、HLA-DR-ECD、CD86-PE、CD4-APC，在各管加入含DC的培養液，在2 000 r/min下離心20 s，待DC被完全標記后避光反應20 min，隨后每管加入生理鹽水100 μl，充分混勻后2 500 r/min離心2 min，取細胞沉淀置于流式管，在5 min內上流式細胞儀檢測，CellQuest分析流式結果。

1.2.9ELISA檢測DC上清液中TNF-γ、IL-6和IFN-α水平 離心3 000 r/min，20 min收集DC上清液，隨后分別根據TNF-γ、IL-6和IFN-α細胞因子試劑盒測定上清中TNF-γ、IL-6和IFN-α濃度。

1.2.10細胞劃痕實驗 使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm 1條，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個DC，待過夜鋪滿。使用時槍頭盡量垂直于背后的橫線劃痕，不能傾斜。PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，在孔板中央滴加少量分離得到的T細胞進行遷移誘導。放入37℃、含5%CO2培養箱中培養。72 h取樣，拍照，計算遷移率。

2 結果

2.1CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞純度 流式細胞術檢測尼龍毛柱分離后的T淋巴細胞亞型情況。結果顯示(圖1)，含有T細胞表面標志分子CD3+的細胞約占93%，說明分離得到的T細胞純度較高。檢測其T細胞亞群情況，其中CD3+CD4+細胞約占35%，而CD3+CD8+T細胞約占49%。

圖1 T淋巴細胞亞群檢測情況Fig.1 Detection of T lymphocyte subsets

2.2DC細胞鑒定 經過肝癌細胞裂解液處理后的DC，光鏡下可見細胞聚集現象，聚集細胞多呈圓形，星形，細胞膜清晰且光滑。大多數細胞失去樹突狀外觀，少部分細胞周圍產生多個不等的突起，有的較長，但仍見梭形(圖2A)。CD1a和CD83分別為DC特異性和成熟的細胞標志物，流式細胞術檢測發現，CD1a+細胞比例約為92%，同時CD1a+CD83+細胞約占83%(圖2B)。

圖2 DC鑒別Fig.2 Identification of DCNote: A.Morphology of dendritic cells under inverted microscope;B.DC purity assay.

2.3DC中miR-618表達情況 在DC誘導第0、2、4、6、8天熒光定量PCR檢測細胞中miR-618表達，結果發現(圖3)，在誘導0、2、4 d，miR-618表達無顯著變化，但經肝癌細胞多種抗原刺激后，在第4天miR-618表達呈時間依賴性下調(P<0.05)。

圖3 DC誘導分化期間miR-618表達情況Fig.3 miR-618 expression during the induction of DCNote:Compared with 0 d,*.P<0.05；compared with 6 d,#.P<0.05.

2.4miR-618靶向下調SOCS1表達 RNA22靶向關系預測網站顯示，miR-618與SOCS1存在多個結合堿基位點(圖4A)，與此同時，雙熒光素酶報告系統也驗證了它們之間的靶向關系(P<0.05)(圖4B)。此外，檢測miR-618過表達后，HEK-293T細胞中SOCS1表達情況，結果表明與mimic NC相比，SOCS1蛋白表達顯著下調(P<0.05)(圖4C、D)。

圖4 SOCS1與miR-618靶向關系Fig.4 Targeting relationship between SOCS1 and miR-618Note:A.Binding sites between miR-618 and SOCS1;B.Luciferase activity of HEK-293T cells in each group;C.Protein bands of SOCS1;D.Relative expression of SOCS1 protein.Compared with HEK-293T cells co-transfected with mimic NC and SOCS1-3′UTR-WT,#.P<0.05；compared with mimic NC group,*.P<0.05.

2.5miR-618靶向下調SOCS1促進DC活化 流式細胞術檢測成熟DC表面抗原CD11c、 HLA-DR、CD86、CD4的表達，結果表明(圖5)，與各組對照相比，miR-618 mimic組和SOCS1 shRNA組CD11c、HLA-DR和CD86陽性細胞顯著增多，但CD4陽性細胞無顯著變化。且miR-618 mimic+SOCS1 shRNA組CD11c、HLA-DR、CD86陽性細胞數目增多更為顯著(P<0.05)。

圖5 DC表面抗原分子的表達Fig.5 Surface antigens expression on DCNote:Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

2.6miR-618靶向下調SOCS1促進DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α細胞因子分泌 結果表明(圖6)，與各組對照相比，miR-618過表達組和SOCS1沉默組TNF-γ、IL-6和IFN-α表達顯著上調，聯合組上述因子上調更加顯著(P<0.05)。

圖6 各組DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α水平Fig.6 Expression levels of TNF-γ,IL-6 and IFN-α in each group of DCNote:Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

2.7miR-618靶向下調SOCS1促進DC遷移能力 劃痕實驗檢測T細胞誘導下的各組DC的遷移能力，結果顯示(圖7)，與各組對照相比，miR-618過表達組和SOCS1沉默組DC遷移能力顯著升高，miR-618 mimic+SOCS1 shRNA組更加顯著(P<0.05)。

圖7 各組DC遷移率比較Fig.7 Comparison of mobility in each group of DCNote: A.Cell scratch test results in each group at 0 h and 72 h;B.Migration rate in each group.Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

3 討論

近年來表明研究DC為啟動、調控以及維持免疫應答機制的中心環節，基于DC的基因免疫治療在多種腫瘤相關的動物實驗以及臨床試驗中也取得了越來越多的成果[11-13]。本研究從DC基因免疫治療在肝癌中的應用角度出發，探討了miR-618靶向SOCS1對肝癌患者DC表型以及功能的影響，結果表明miR-618能夠靶向抑制SOCS1進而促進肝癌患者DC活化，促進免疫調控功能的提高。

首先本研究組發現，miR-618在DC誘導期間呈時間依賴性下調。前人的研究早就證實miRNA參與了DC的分化，同時與腫瘤的生長和免疫調控有關，將miRNA作為靶點進而增強DC的免疫功能也被越來越多的應用于癌癥的免疫治療中[14，15]。如有研究發現miR-128能夠通過靶向p38進而增強DC介導的抗腫瘤免疫[16]。miR-618以往被發現在甲狀腺癌以及前列腺癌等癌癥中發揮抑癌因子的作用[9,10]，但是其在肝癌中是否發揮作用以及具體的作用機制尚未明確。Rossato等[17]在關于系統性硬化的研究中發現，相對于健康對照組，系統性硬化患者漿細胞樣DC中miR-618的表達顯著減少，miR-618可能是對系統性硬化患者免疫系統穩態進行調節的重要靶點。本研究進一步探究了其在肝癌免疫中的作用并且發現其在DC誘導分化期間的表達變化。

本研究通過生物信息學靶向關系預測網站發現SOCS1與miR-618之間存在靶向結合位點。細胞因子是一種由細胞分泌的，能夠對細胞的生長、分化和增殖進行調控的多肽小分子，其主要通過信號轉導途徑進而實現生物學效應的發揮[18]。SOCS家族為JAK/STAT信號通路的負性調控分子家族，研究證實其能夠調控DC以及巨噬細胞的活化，同時對于T細胞的生長和分化過程必不可少[19]。SOCS1是SOCS家族的重要成員，研究證實SOCS1能夠對DC活化過程中的IL-6，IL-12、TNF-α以及IFN-γ等細胞因子進行調節[20]。同時，SOCS1缺陷的DC能夠誘導更強的抗腫瘤免疫效應。如Guenterberg等[21]在研究中表明，SOCS1缺陷的小鼠具有更高的IFN-α表達水平，其抗腫瘤免疫功能也顯著增強。以上研究均表明了SOCS1在DC功能調節以及抗腫瘤免疫中的重要價值。我們在本研究中也同樣證實了沉默SOCS1在肝癌免疫調節中的重要價值并且表明SOCS1功能的發揮受其靶向miRNA的調控。流式細胞術檢測DC表面抗原發現，過表達miR-618或沉默SOCS1能夠促進DC活化且二者聯合效果更明顯，這也進一步證實了miR-618靶向SOCS1參與了肝癌患者中DC的活化。T細胞在機體的抗腫瘤免疫調節中發揮重要作用[22]。本研究通過ELISA法對各組促進T細胞分化成熟相關因子的表達進行檢測發現，過表達miR-618或沉默SOCS1能夠顯著促進DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α等細胞因子的表達。進一步檢測各組DC的遷移能力發現miR-618過表達組和SOCS1沉默組DC遷移能力顯著增強且聯合組效果更顯著，說明了miR-618通過對DC進行調節進而參與肝癌免疫。

綜上所述，miR-618能夠靶向抑制SOCS1的表達進而促進肝癌患者中DC活化，增強其免疫調控能力，miR-618有望成為肝癌免疫治療中的一個重要靶點。