CpG ODN協同小鼠肝癌細胞裂解物對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究①

孫 鵬 李歡歡 王衛芳 竇 瑤 周曉晶

(長春中醫藥大學臨床醫學院，長春 130117)

肝癌是最常見的肝臟原發惡性腫瘤，其致死率極高[1]。尋找抗肝癌免疫中有效靶抗原是抗肝癌免疫的難題[2]。在腫瘤細胞裂解物(tumor cell lysate,TCL)中含有豐富的腫瘤相關抗原(tumor associated antibody,TAA)，因此腫瘤細胞內所有抗原都可能是免疫攻擊靶點，從而引起作用更強的抗肝癌免疫反應[3，4]。但腫瘤抗原的免疫原性弱，研究者們嘗試了多種方法來提高TCL的免疫原性。常用的方法包括：用DC裝載 TCL、以HSP為佐劑等[5，6]。Dong等[7]研究發現，結核分枝桿菌的HSP65能協助lewis肺癌的細胞裂解物誘導抗肺癌免疫反應。此外，人們也研究了含有胞苷酸-鳥苷酸的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)與肝癌細胞裂解物聯合應用的效果，CpG ODN是一種Th1型免疫增強劑，刺激機體產生Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12等，并且能夠輔助TAA產生CTL反應從而清除腫瘤細胞[8]。Dong等[9]研究發現，CpG1826能增強TCL的免疫原性，從而應用于人類HPV病毒永生化的腫瘤模型中。因此CpG ODN或許會輔助TCL誘導抗肝癌免疫。根據以上推測，我們將小鼠肝癌細胞H22的TCL與具有免疫刺激增強作用的C型CpG ODN聯合應用于小鼠原位移植性肝癌模型，研究其抑瘤效果及機制。

1 材料與方法

1.1材料 H22細胞株由本實驗室液氮冷凍儲存，為懸浮生長，使用含10%FBS IMDM培養基，培養于5%CO2、37℃培養箱中。純化的單鏈寡聚脫氧核苷酸購自日本TaKaRa大連分公司(OPC級，純度90%，HPLC級，純度99%)。IFN-γ、IL-17檢測試劑盒購自R&D System公司。本研究使用的CpG ODN序列如下：C274(5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′)，被溶于無菌PBS中，紫外分光光度計定量，檢測內毒素<0.03 EU/mg，符合動物實驗要求，于-20℃ 冷藏備用。雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，18～22 g，購自吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心。

1.2方法

1.2.1TCL的制備和鑒定 將生長狀態良好的H22細胞用PBS洗滌、計數后取適量細胞制成細胞懸浮液。將細胞懸液于37℃水浴和-70℃冰箱中反復凍融5次，期間震蕩混合20 s。用臺盼藍染細胞并于顯微鏡下觀察細胞狀態，保證沒有活細胞存在。將制備合格的 TCL 放于-70℃冰箱中凍存備用。

1.2.2小鼠原位移植性肝癌模型的建立 將 1×107個H22細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，1周后形成腹水。取腹水分離H22細胞并計數，以2×106個細胞注射于小鼠右后腿外側皮下。待腫瘤直徑 1 cm 左右分離腫瘤組織于冰冷無菌PBS中，顯微鏡下將瘤塊剪碎至直徑(1.2±0.2)cm，將瘤塊種植于小鼠肝臟。

1.2.3原位移植性肝癌接種及免疫 BALB/c小鼠隨機分為4組，每組10只。在-1 d每只小鼠肝內接種肝癌組織，然后于0、7、14、21 d經雙側腹股溝淋巴結引流區皮下分別注射PBS、TCL(2×106個/只)、CpG ODN(12.5 μg/只)和CpG ODN(12.5 μg/只)+TCL (2×106個/只)，監測小鼠生存期。

1.2.4CTL殺傷實驗 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細胞并用TCL刺激培養。培養24 h時，加入小鼠IL-2(20 U/ml)繼續培養24 h。然后離心并計數。刺激后的脾細胞作為效應細胞， H22細胞作為靶細胞進行殺傷實驗。5×105個脾細胞稀釋后與靶細胞共同培養，效靶比分別為12.5∶1、25∶1及50∶1。4 h后收集細胞并用臺盼藍染色，于顯微鏡下觀察存活的細胞，體積較大的細胞為H22細胞并計數，每毫升中的細胞數=四象限中的細胞總數/4×稀釋倍數×104，4個象限的細胞總數必須介于200～500個之間，而且細胞濃度要超過104個/ml。按以下公式確定CTL殺傷情況，CTL細胞毒性%=(靶細胞對照孔細胞數-實驗孔細胞數)/靶細胞對照孔細胞數×100%。

1.2.5Th1型細胞因子的檢測 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細胞并與TCL共同孵育24 h，收集刺激上清并用IFN-γ和IL-12檢測試劑盒檢測IFN-γ和IL-12的水平。

1.3統計學分析 所有結果應用 SPSS17.0 軟件進行分析，生存曲線用Kaplan-Meier方法繪制；腫瘤發生率用Fish檢驗進行比較。組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CpG ODN與TCL聯合應用對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用 BALB/c小鼠肝內接種瘤塊后，給其注射PBS、TCL、CpG ODN、CpG ODN+TCL，觀察小鼠生存期。結果如圖1B所示，與其他組相比CpG ODN+TCL組的小鼠生存期明顯被延長了(P<0.05)，到77 d各組小鼠的存活率分別是PBS組20%、TCL組20%、CpG ODN組10%、CpG ODN+TCL組80%。每只小鼠死亡后分離其腫瘤組織如圖1A所示，CpG ODN+TCL組小鼠10只有2只成瘤并且分別于接瘤后48 d和53 d死亡，其他8只小鼠均未成瘤，這8只小鼠直到77 d全部成活且狀態良好。而其他各組成瘤率均在80%以上，且相繼死亡。

圖1 CpG ODN+TCL對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of CpG ODN+ TCL against orthotopic-transplantated liver cancer in miceNote:A.Tumors in liver from dead mice.PBS.dead/total=8/10,TCL.dead/total=8/10,CpG ODN.dead/total=9/10,CpG ODN+TCL.dead/total=2/10；B.Survival of mice with orthotopic-transplantated liver cancer.*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.2CpG ODN協同TCL誘導小鼠脾細胞增殖反應 BALB/c小鼠被隨機分為4組，末次免疫后7 d，取小鼠脾，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠的脾較其他兩組明顯增大，見圖2A。分離脾細胞并計數，計數結果如圖2B所示，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠脾細胞數分別是1.8×108個和1.78×108個，遠遠高于PBS組、TCL組的脾細胞數(P<0.05)，但二者之間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 CpG ODN協同TCL對小鼠脾的影響Fig.2 TCL adjuvanted CpG ODN induced response of spleen in miceNote:A.Morphology of spleens from three mice after 7 d of the last injection.Sizes of the spleens were compared based on the scale；B.Lymphocyte numbers in spleens from three mice.Each bar represents of lymphocyte number from spleens(down).*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05 vs TCL group.

2.3CpG ODN協同TCL誘導特異性CTL反應 殺傷結果如圖3所示，當效靶比為分別為25∶1和50∶1 時，來源于CpG ODN+TCL免疫鼠的脾細胞能裂解H22細胞，裂解率分別為48%和51%，而其他各組均無裂解效應(P<0.05)。

圖3 CpG ODN協同TCL誘導了CTL反應Fig.3 CTL respense induced by CPG PDN+TCLNote:*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.4CpG ODN協助TCL誘導小鼠分泌Th1型細胞因子 結果如圖4所示，CpG ODN+TCL組與CpGODN組產生的IFN-γ 和 IL-12水平均較高，均為PBS組及TCL組的2倍左右(P<0.005)，且兩組間無差異(P>0.05)。

圖4 CpG ODN協助TCL誘導小鼠分泌Th1 型細胞因子Fig.4 Th1 biased cytokines induced by CPG ODN+TCL in miceNote:A.Levels of IFN-γ；B.Levels of IL-12.*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05,vs TCL group.

3 討論

在TCL制備過程中本研究組發現其含有分子量不同的多種蛋白質，這些蛋白質中一定有豐富的腫瘤抗原存在腫瘤抗原的免疫原性弱，不足以誘導產生特異性的腫瘤殺傷反應。而C型CpG ODN具有強大的免疫刺激作用，作為Th1型免疫佐劑可增強抗原的免疫原性，研究組也證實了其能夠協同TCL有效的抑制原位移植性肝癌的發生和延長小鼠的生存期。

本研究組推測CpG ODN與TCL聯用對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用與CpG ODN能協助TCL誘發特異性細胞免疫反應進而殺傷腫瘤細胞有關。CpG ODN能通過以下途徑協同TCL產生特異性細胞免疫反應清除肝癌細胞。第一，本研究組另一個研究發現CpG ODN能上調MHC Ⅰ分子的表達，從而促進TCL遞呈及交叉遞呈[10]。第二，CpG ODN通過刺激B細胞和pDC產生IL-12 和 IFN-γ，為TCL提供Th1免疫環境,促進CD4+T細胞分化為Th1 CD4+T 細胞，使CTL浸潤到腫瘤位點特異性清除腫瘤細胞。而且IL-12還能誘導T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，它能提高肝癌細胞的MHC分子和共刺激分子的表達，從而使肝癌細胞更容易被CTL識別和清除。本研究中，發現單獨使用CpG ODN或將其與TCL聯用明顯促進了小鼠脾細胞增殖、促進了IFN-γ 和 IL-12的分泌，且兩者之間無差別，說明了CpG ODN有強大的免疫增強作用和促進Th1型細胞免疫反應作用。在進一步的CTL殺傷實驗中，CpG ODN能協助TCL殺傷肝癌細胞，說明CpG ODN促進的Th1型細胞免疫反應增強了TCL特異性腫瘤細胞殺傷反應。而單獨應用CpG ODN卻沒有這樣的作用，說明CpG ODN雖能具有免疫刺激作用，但在沒有腫瘤抗原存在的情況下CpG ODN的免疫刺激引起的非特異性抗腫瘤效應不足以抑制腫瘤細胞的生長，這也與在抑制腫瘤實驗中CpG ODN與TCL聯合有抑瘤效果而單獨使用沒有效果相統一。說明CpG ODN與TCL聯用的抑瘤效果是通過誘導了特異性細胞殺傷反應清除腫瘤細胞實現的，具體機制還需進一步研究。