HSCCC 分離天然產物中化學成分研究進展

梁元昊 徐文麗 胡瑞雪 劉玉峰

（1.遼寧大學藥學院， 遼寧沈陽110036； 2.遼寧省天然產物制藥工程技術研究中心， 遼寧沈陽110036）

從天然產物（包括瓜果蔬菜、酒渣醬料） 中分離制備活性有效成分并將用于疾病治療，正受到越來越多人的重視，但上述成分種類過多，故對其提取分析是一個非常復雜的過程［1?2］。天然產物的傳統分離方法存在純度低、分離不徹底、樣品變性等問題，從而阻礙了對有效化學成分性質的研究［3］，故如何對其進行分離，進而實現資源深度利用，得到高產率、高純度活性物質是當前重點。

高速逆流色譜（HSCCC） 是由美國國立衛生研究院Ito博士在20 世紀80 年代最先研制一種獨特的液?液分配色譜法，它將分析物分配成2 種互不相溶的液體，被分離組分在該溶劑系統中具有不同的溶解度，進而產生分配系數差，使目標化合物能依次被流動相洗出，從而實現組分分離，已廣泛地應用于創新藥物、植物提取、保健品、天然產物、化妝品等行業中［4?5］。本文對HSCCC 在天然產物活性小分子分離、多肽和蛋白質等生物大分子分離、手性分離方面進行概述，以期為分離純化高產率、高純度有效化學成分提供一種新的分析方法與思路。

1 HSCCC 概述

1.1 優缺點 HSCCC 不需要固定載體作為固定相，可大容量負載，具有高標本負載能力和目標分析物的高回收率［6］；與柱色譜法、HPLC 制備方法相比，它進一步放大了分離、制備過程，避免了常規分離方法可能導致在分離、純化階段由于不可逆的吸附而損失活性成分或分解的問題；能輕松有效地分離具有相似骨架和極性的組分［7］。但該方法在溶劑體系的選擇和優化方面，尚無更充分的理論依據，需要根據主觀經驗進行多次實驗，進而篩選出較佳的溶劑系統，有一定的隨機性和繁瑣性；分離效果易受到兩相密度差［8］、溫度、體積流量、轉速等因素的影響［9］；消耗溶劑過多，一次分離時間過長（以小時計）［10］；制備分離量還不能達到公斤級的分離純化［11］，故仍需要進一步改進與完善。

1.2 溶劑體系選擇 在使用HSCCC 分離天然產物活性成分時，最大的問題是如何選擇一個正確的溶劑系統，對其篩選可占總分析時間的90%［12］。HSCCC 兩相溶劑體系較穩定，溶劑系統分層時間主要分成3 類，疏水性溶劑體系通常為5～16 s，親水性溶劑體系一般為38～59 s，中性溶劑體系為19～29 s［13］，一般條件下，溶劑系統不會引起樣品的分解、變性，而且其溶解度較高，故目標化合物在兩相溶劑系統中分配系數的選擇范圍要恰當，一般在0.5～2之間［14］。由此確定，HSCCC 溶劑系統［15］在強極性溶劑體系中常用雙水相，如正丁醇?水、乙酸乙酯?水；中等極性溶劑體系中主要是氯仿?水、乙酸乙酯?水，可在此基礎上添加正丙醇、甲醇、異丙醇、正己烷、正丁醇等來調配比例；對于弱極性溶劑體系，可采用正己烷?水、石油醚?水、三氯甲烷?水基本體系，同時添加乙酸乙酯、甲醇進行調配。此外，無水溶劑體系也是理想的選擇，由于其不含水，故回收溶劑較方便，而且樣品后處理更便捷，節約了成本，目前應用最廣泛的是正己烷?乙腈體系，采用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷對其進行調配［16］。

2 應用HSCCC 分離化學成分

2.1 天然產物活性小分子 天然產物主要化學成分包括生物堿、苷類、黃酮、蒽醌、甾體、萜類、香豆素、揮發油、酚類、植物色素類、糖類、脂類等［17］，并且不同種類化合物的藥理作用也有所差異［5］。

2.1.1 多酚 多酚是食品中最豐富的抗氧化劑，富含該成分的天然產物或飲料都與預防某些慢性疾病（如癌癥和心血管疾病） 有關［18］。HSCCC 是一種全液相色譜系統，它在一定程度上消除了多酚的分離過程中的不可逆吸附和尾影形成［19］，主要采用2 種溶劑系統，當多酚分子量較小時，主要采用中等極性溶劑，如氯仿?甲醇?水、正己烷?水?甲醇?乙酸乙酯等［20］；當其分子量較大時，主要采用正丁醇?水等極性較強的溶劑體系［21］，具體應用時可適當對溶劑進行調整。

Peng 等［22］在最優條件下采用正己烷?乙酸乙酯?水（3 ∶17 ∶20）、乙酸乙酯?甲醇?水（50 ∶1 ∶50） 溶劑體系，通過兩步分離成功地從柿子中得到出7 種主要多酚，純度均高于95.0%，并且發現HSCCC 在制備二聚原花青素方面具有明顯的優勢。Kohler 等［23］將葡萄籽提取物黃烷?3?醇間苯三酚加合物在乙酸乙酯?甲醇?水（1 ∶5 ∶0.1 ∶5、1.5 ∶10 ∶1.5 ∶10） 體系下直接用HSCCC 全液相色譜技術進行分離，發現所得餾分中含有純度極高的化合物，實現了對二聚體到四聚體原花青素的分離。此外，HSCCC 分離低聚原花青素時已證實可應用于半制備規模上，在某些情況下可采用制備型高效液相色譜法進行最終純化。Jiang 等［24］建立了一種簡便、快速、峰容量顯著提高的離線二維HSCCC，分別以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（3 ∶5 ∶3 ∶5）、乙酸乙酯?正丁醇?水（7 ∶3 ∶10） 為第1、第2 維兩相溶劑體系，成功從苦蕎粗提物中分離出槲皮素3?O?蘆丁苷、蘆丁、山柰酚?3?蘆丁苷、槲皮素、山柰酚，純度均在96%以上，可為苦蕎新制劑、功能性產品開發及進一步生物測定提供理論依據。Wen 等［25］采用HPLC?HSCCC 聯用技術，以氯仿?甲醇?水?正丁醇（4 ∶3 ∶2 ∶1.5） 為溶劑從山楂葉中分離得到4 種黃酮，純度均在98%以上。

2.1.2 生物堿 Sutherland 等［26］報道了通過HSCCC 分離純化天然產物有效成分的研究概況，涵蓋了來自56 個科、108 種植物，從中分離了354 個化合物，其中關于生物堿的文獻有56 篇，占化合物總數的16%。Guo 等［27］將HSCCC 與HPLC?DAD?QTOF?MS／MS 分析相結合，選擇石油醚?乙酸乙酯?甲醇?水（8 ∶4 ∶7 ∶5） 作為溶劑體系來分離厚樸粗提取物，并將2 種主要木脂素、厚樸酚剔除后，對生物堿等微量成分進行富集，再通過保留時間、UV、準分子離子、裂解途徑結合比對標準品或已知化合物，初步確定了其結構。Zou 等［28］采用重結晶法預處理蘆薈乙醇提取物，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（5 ∶2 ∶5 ∶3） 為溶劑一步合成了3 種喹諾酮類生物堿｛1?甲基?2 ［（6Z，9Z） ?十五碳二烯基］ ?4 （1H） ?喹諾酮、二氫玫瑰堿、1?甲基?2?十五烷基?4 （1H） ?喹諾酮｝，然后以5 ∶3.5 ∶8.75 ∶8.25 比例從各亞組分中又分離出3 種喹諾酮類生物堿［1?甲基?2?十一烷基喹啉?4 （1H） ?酮、（Z） ?1?甲基?2? （十三碳?5?烯?1?基） 喹啉?4 （1H） ?酮、1?甲基?2?壬基喹啉?4 （1H） ?酮］。劉德明等［29］采用HSCCC 對正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、水等溶劑進行搭配組合以篩選溶劑體系，發現石油醚?乙酸乙酯?甲醇?水（5 ∶1 ∶2 ∶4） 分離生物堿類的效果最佳，并從黃柏粗提物中分離得到小檗堿、黃柏堿、巴馬丁和白瓜蔞堿，純度均可達95%以上。

2.1.3 皂苷 由于苷分子中所連糖基較多，極性較大，以固體為載體的傳統方法對其分離時易造成死吸附，HSCCC技術被證明是分離此類物質的理想方法，對降低分離提取成本、提高產品質量有重要的意義［30］。在分離極性較小的單糖苷時，主要采用醋酸乙酯?甲醇?水、氯仿?甲醇?水、正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水溶劑體系，并可通過調節其比例來進一步分離不同極性者［31］；對于極性較大的雙糖苷或多糖苷，大多采用醋酸乙酯?正丁醇?水，通過調節正丁醇用量來進一步分離不同極性者［32］，但這并不是絕對的，一般是根據前人經驗來進一步巧妙地縮短分離時間和步驟。

Du 等［33］發現，HSCCC 是一種在實驗室規模上分離三萜糖苷的有效方法，可用于制備苦瓜中純三萜皂苷，首先通過硅膠柱層析法從粗提物中得到2 種三萜皂苷，進而使用不同比例甲基叔丁基醚?正丁醇?甲醇?水溶劑體系作進一步分離純化。Ma 等［34］以正丁醇?乙酸? 6 mmol／L 醋酸銨水溶液（4 ∶1 ∶5） 為溶劑體系，采用HSCCC?ELSD 技術，成功地從大蒜粗提液中一步分離純化出4 種甾體皂苷，從300 mg 粗品中分離得到4 個化合物，純度可達93.0%以上，這也是上述聯用技術首次用于分離和純化該類成分。

2.1.4 其他 HSCCC 已被用于純化足量的抗微生物化合物，用于測定天然抗菌化合物的抑制譜和作用方式［35］。Liang 等［36］將HSCCC 作為羥基不飽和脂肪酸的純化方法，可獲得足夠量以研究對菌絲體真菌、分生孢子、酵母的抑制譜。Wu 等［37］將HSCCC 與超臨界萃取相結合，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（7 ∶3 ∶8 ∶2） 為溶劑體系，成功提取分離了山蒼子中對甲氧桂皮酸乙酯和肉桂酸乙酯，兩者純度分別為98.4%和98.1%，有效解決了由于常規分離技術中精力、溶劑消耗大，樣品、對照品損失多的問題。Wei等［38］引入HSCCC 來純化番茄紅素，以正己烷?二氯甲烷?乙腈（10 ∶3.5 ∶6.5） 為非水溶劑體系，得到了純度高于95%的該成分。Zou 等［39］建立了一種基于三相溶劑體系液?液萃取和HSCCC 來快速富集蟾蜍肉中微量丁二烯內酯4 個差向異構體的方法，首先選擇響應面法優化后的正己烷?乙酸甲酯?乙腈?水（3 ∶6 ∶5 ∶5） 溶劑體系對粗提液進行液?液萃取，再用氯仿?甲醇?水（4 ∶2 ∶2） 溶劑體系進行富集，有助于蟾蜍肉的定量分析和安全性評價。

2.2 多肽、蛋白質等生物大分子 蛋白質作為天然產物中的第一大營養素，對生物體內的生命活動起著重要作用，基于此，由其降解得到的生物活性多肽也引起了人們廣泛關注。HSCCC 主要采用雙水相溶劑系統和含有丁醇的體系來用于蛋白質、多肽的前處理，對復雜樣品粗分時再通過其他分離技術來得到高純度樣品［40］，但由于溶劑體系比較單一，難以達到完全分離的條件，所得成分的種類也有限，導致該技術局限于簡單二肽、中極性或弱極性的肽類衍生物的分離［41］。因此，基于HSCCC 分離蛋白質和多肽的分析主要集中于其標準品分離，以便于研究儀器分離效率與機理，從而進一步實現中試放大［42］。

Li 等［43］使用HSCCC 結合反膠束溶劑系統，開發了一種從苦瓜果實中分離蛋白質的新方法，這也是首次在苦瓜中發現該成分。另外，HSCCC 在分離蛋白質等大分子時，由于有機溶劑會使生物大分子及細胞發生不可逆的結構和性質改變，故通常選用雙水相體系［44］。郅文波等［44］采用多分離柱高速逆流色譜研究聚乙二醇1000?磷酸鹽雙水相體系的固定相保留率，以及該體系對蛋白質混合物和雞蛋清的分離效果，發現pH 為9.2 時細胞色素C、溶菌酶、血紅蛋白的分配系數差異最大，在體積流量10 mL／min、轉速850 r／min 的條件下成功地分離了雞蛋清，得到了卵白蛋白、溶菌酶、卵轉鐵蛋白。

2.3 天然產物手性分子 在分離天然產物手性分子中的單體化合物時，由于異構體分子性質不同，通常只有一種異構體具有較強生物活性，而另一種基本無活性或活性較弱，或具有不同藥理活性甚至毒性［45］，如何從中分離得到單一的異構體是急待解決的問題。隨著高效手性添加劑的發現和逆流色譜儀器的進一步完善，近年來HSCCC 在相關方面已經得到了成功應用。通過HSCCC 分離羧酸、糖苷、萜類生物堿等異構體時，主要使用乙酸乙酯?水、正丁醇?水等強極性體系；分離多酚、苯丙類、苷類、芳香酸等異構體時，大多采用甲基叔丁基醚?水、正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水等中等極性體系。此外，還可采用逆流色譜閉路循環、多重雙向洗脫模式等多樣化洗脫模式適當提高異構體分子間的色譜分離度［46?47］。

2.3.1 立體異構 兒茶素、表兒茶素互為構象異構體，均屬于黃烷醇多酚類化合物，但對兩者大量制備分離方法的研究報道較少。成超等［48］采用HSCCC 實現了2 種成分的完全分離，在120 min 內以正己烷?乙酸乙酯?水（1 ∶20 ∶20） 為溶劑系統，得到了兩者純度分別在99%、95%以上，同時在柱體積放大約6 倍的情況下可獲得上樣量放大50 倍的理想制備分離效果，這正是該技術的優勢所在［48］。段文娟等［49］采用乙酸乙酯?正丁醇?甲醇?水（5 ∶0.7 ∶1 ∶5）、乙酸乙酯?正丁醇?甲醇?水（5 ∶0.5 ∶1 ∶5） 作為溶劑體系，從連翹果實中分離制備了2 對木脂素類立體異構，即（＋） 松脂醇單甲醚?β?D?葡萄糖苷和連翹苷、（＋） 松脂醇?β?D?葡萄糖苷和（＋） 表松脂醇?4′?O?β?D?葡萄糖苷。

2.3.2 構造異構 在HSCCC 一步法分離過程中，有時很難找到理想的高純度溶劑體系，制備高效液相色譜法（prep?HPLC） 常作為額外的分離步驟來實現HSCCC 和HPLC 之間的互補作用［50］。在大黃蒽醌糖苷傳統的分離過程中，通過二氧化硅、凝膠色譜法分離大黃酚1?O?β?D?葡萄糖苷、大黃酚8?O?β?D葡萄糖苷2 種異構體時存在很大的困難，Chen 等［51］通過prep?HPLC 結合HSCCC 成功分離了兩者。孫文宇等［46］開發了大孔樹脂?洗脫?推擠逆流色譜法，以正丁醇?乙酸乙酯?水（2 ∶3 ∶5） 為溶劑體系從30%白芍乙醇提取物中分離得到了芍藥苷和芍藥內酯苷，再采用洗脫?推擠逆流色譜和普通逆流色譜，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（0.5 ∶5 ∶1 ∶5） 為溶劑體系，從其95% 提取物中分離得到苯甲酰芍藥苷、6′?O?苯甲酰芍藥內酯苷，純度均高于95%。

3 結語

國內外關于從天然產物中分離純化單體化合物的工藝優化過程報道較少，基本上仍停留在溶劑提取、常壓柱色譜水平，傳統分離方法對含有量低、結構和性質相似、不能結晶組分的分離提純常受到限制，存在固態載體吸附損耗、樣品變性、回收率低等問題。HSCCC 可在短時間內實現高效分離和分析，具有無固體載體、避免分離樣品與固體載體表面產生化學反應而變性、不可逆吸附等優點，而且對樣品預處理要求較低，適用于粗提取物分離，從而提供了更便捷、更有效、產率和純度更高的提取方法，極大地減少了昂貴標準品購買成本及樣品制備富集負擔。但該技術在溶劑體系的選擇和優化方面尚無更充分的理論依據，只能根據經驗來減少實驗次數，進而篩選出較佳的溶劑系統，故仍需要繼續探索如何能在此基礎上進一步創新，使其逐漸發展成一種應用更廣的色譜技術。