基于聚酰胺—胺樹枝狀聚合物的牙體硬組織仿生再礦化的研究進展

向科臻 陳亮 楊德琴

重慶醫科大學附屬口腔醫院 口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室

重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶 401147

人牙硬組織的形成是典型的生物礦化過程，即在有機基質模板誘導下的晶體的成核、生長、聚集以及取向[1-2]。基于此“有機基質調控理論”，在近年來仿生礦化的研究中，人們逐漸認識到有機大分子是生物礦化和仿生合成的核心，生物材料的分子仿生設計也隨之成為了現代硬組織修復材料設計的主導思想。采用有機模板誘導牙體組織仿生礦化的主要過程如下：先形成有機物的自組裝體作為礦化模板，隨后無機先驅物在自組裝聚集體與溶液相的界面處發生化學反應，再由有機模板調控無機晶體的成核、生長、取向、形態、大小和顯微結構[3-4]。仿生礦化的關鍵是尋找可誘導和調控晶體形成與生長的有機物模板，盡管提取天然釉原蛋白用于人牙釉質表面再礦化的效果值得肯定，但人體內的礦化基質提取成本較高且容易受pH值、氟濃度等環境改變影響[5]，因此是否能發現或合成與之功能相仿的人工替代物成為了近年來的研究熱點[6]。

聚酰胺—胺樹枝狀聚合物（polyamidoaminedendrimer，PAMAM）就是其中之一，其具有天然非膠原蛋白相似的形態和功能特點，被稱之為“人工蛋白”[7]。20世紀80年代初，Tomalia等[8]通過反復加成反應首次發明合成了PAMAM（以乙二胺或氨為引發核，聚合反應由引發核向外逐級發生）。PAMAM不僅具有三維結構、高度支化、分子內部空腔和表面基團易于改性等特點，還具有良好的生物相容性、低毒性和無免疫源性，是目前研究最為廣泛的樹枝狀聚合物之一[9-10]。這些特點使PAMAM可以被用作仿生大分子，模擬天然有機基質在牙體組織表面進行仿生礦化，即PAMAM作為有機模板調控礦物質成核以及晶體的生長，以此來建造比傳統的異體材料更加理想的牙體修復材料。已有越來越多的研究開始將PAMAM應用到牙體硬組織仿生礦化中，并取得了值得關注的結果。本文旨在對近年來PAMAM在牙科方向上仿生礦化的研究進行綜述，為今后的研究工作墊定基礎。

1 PAMAM與牙體硬組織仿生再礦化

PAMAM在模擬生物礦化方面有巨大潛能，然而其在牙體硬組織仿生礦化中的作用機制尚不明確。推測牙本質脫礦導致膠原-COOH末端暴露在空氣中，隨后在肽鍵凝聚劑作用下，裸露的-COOH末端與PAMAM的-NH2端結合，形成酰胺鍵（-CO-NH-）接枝有機蛋白，成為仿生礦化的有機控制模板。

Jia等[11]通過掃描電子顯微鏡觀察到，脫礦牙本質經第4.0代PAMAM（G4-PAMAM）處理后的超微結構改變，礦化液中浸泡8周后，牙本質管口被一層扁平、環形的晶狀沉積覆蓋，部分阻塞了牙本質小管，與去離子水處理的空白組相比，PAMAM組小管的直徑和數目均顯著減少，意味著可減緩牙本質內液體的快速流動。G4-PAMAM具有治療牙本質過敏癥的潛在價值[11-13]。林軒東[14]通過Pramanik水化學反應制備的聚酰胺-胺/納米羥磷灰石（polyamideamine/nano-hydroxyapatite，PAMAM/n-HAP）納米復合生物材料，也具有同樣作用。盡管PAMAM誘導牙本質小管封閉速率慢于脫敏劑中常用的NaF，但在28 d后獲得了同樣效果，且具有更強的耐酸性，意味著其后期封閉效果更加穩定[15]。

PAMAM的再礦化作用不僅可用于治療牙本質過敏癥，還可以用于齲壞、酸蝕、機械作用等原因導致的缺損牙體的修復， Zhou等[16]探討了三氯生負載的PAMAM-COOH樹狀大分子在人牙本質上的應用，結果顯示PAMAM不僅能夠作為藥物載體吸附于牙本質表面，而且在局部釋放抗菌藥物的同時可作為仿生礦化的有機模板劑修復損傷牙本質，該結果提示了PAMAM在齲病修復材料方面也具有廣闊的應用前景。

以PAMAM為模板研究牙體硬組織仿生礦化的過程中，改性后的PAMAM具有的多功能性逐漸引起了學者關注。雖然近年來越來越多的研究證實了在代數、表面基團、濃度以及作用時間等條件差異下， PAMAM始終在牙體硬組織表面具有形成晶體修復層的能力，并給出了一定的解釋及推測，但由于HAP礦物晶體的成核和結晶過程非常復雜，因此該影響機制還未有明確且公認的解釋。

學者[17-18]研究發現，攜帶不同官能團的PAMAM，如端羧基PAMAM（PAMAM-COOH）、端羥基 PAMAM（PAMAM-OH）、端氨基 PAMAM（PAMAMNH2）均可吸收牙本質膠原纖維中的 Ca、P離子并作為牙本質仿生礦化模板，掃描電子顯微鏡觀察到經過14 d人工唾液浸泡后，G3-PAMAM-COOH處理的牙本質纖維表面清晰可見無定形磷酸鈣納米球，G4-PAMAM-COOH處理的牙本質形成“玉米芯”狀外觀，至28 d時牙本質表面覆蓋新生礦物，小管幾乎完全被阻塞，證明牙本質纖維間、纖維內有大量礦物質沉積；與之相比，去離子水處理的空白組牙本質管內、外均無明顯礦化，管周膠原纖維呈扁平狀，表明由于纖維內礦物支持不足導致脫水收縮[2]。

釉質與牙本質雖然礦物組成相似，但釉質中碳酸鹽含量更低（約為3%），因而釉質晶體體積大，孔隙度低，耐酸性較好[19]。目前鮮少有報道將PAMAM用于釉質的仿生礦化。Zhang等[20]通過G4.5-PAMAMCOOH在人牙釉質中的實驗形成了定向良好且類似于釉柱的棒狀晶體，其自組裝過程與釉原蛋白相似，即納米球-鏈-微帶結構[21]，并通過人牙釉質在體外以及小鼠口腔環境中的實驗證實磷酸端PAMAM（PAMAM-PO3H2）也有同樣作用，且再生礦物層的厚度均大于10 μm。磷酸基團與羧基基團相比，不僅對Ca離子有更強的絡合能力，與羥磷灰石（hydroxyapatite，HAP）結合能力也更強[22]，推測其原因為磷酸端 PAMAM 和牙本質磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）相似度更高，磷蛋白不僅是牙本質基質中最豐富的非膠原蛋白，且磷蛋白的磷酸化程度可以調控其與HAP的相互作用，進而對HAP的成核和生長產生不同程度的作用[23]。Zhu等[24]用磷酸端基的PAMAM負載芹菜素成功誘導牙本質仿生礦化的同時，對變異鏈球菌也起到了明顯的抗菌作用，該策略為臨床抗齲修復材料的設計提供了思路。

2 PAMAM復合材料在牙體硬組織仿生修復中的研究

近年來與PAMAM有關的生物復合材料因同時具有有機材料和無機材料的優點而成為了牙體修復材料領域新的研究熱點。研究發現，在更貼合實際口腔環境的循環人工唾液/乳酸模型中，PAMAM的仿生礦化效果比以往使用恒定pH值7的研究要弱得多[25]，之后研發出了PAMAM-無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，NACP）復合材料，認為其有提供成核模板、酸中和、鈣磷離子釋放等三重好處，可實現促進再礦化和預防脫礦的雙重效果，但隨著浸泡時間的增加，NACP釋放的鈣、磷逐漸減少，此外浸泡液的沖刷也可能洗掉PAMAM[26-27]。為了開發一種在流體沖擊下依然能維持長期再礦化的方法， Liang等[28]首先對涂布PAMAM的樣本進行72 d的PBS浸泡和振蕩，建立了一個模擬口腔中受激作用超過1年的加速流體激發模型，然后用EBPMNACP復合材料（40%EBPM、40%NACP和20%玻璃顆粒，其中EBPM為一種二甲基丙烯酸酯和均苯四酸甘油的復合物）與涂布PAMAM后的脫礦牙本質接觸并且經過每日23 h人工唾液浸泡+1 h乳酸浸泡，如此持續35 d。值得矚目的是，新型EBPM-NACP復合材料的酸中和離子再釋放并沒有隨著反復“充電”和離子再釋放循環而降低，證明該復合材料可保持長期鈣磷離子釋放；且采用這種PAMAM+EBPMNACP策略下的樣本礦化程度幾乎恢復到了健康牙本質水平。綜上所述，由于PAMAM和“可充電”的EBPM-NACP復合材料之間的協同作用，提供了流體沖擊下牙齒長期再礦化的可能性，也就意味著能夠對牙齒實施長效保護并抑制齲齒的發生。不僅如此，在pH=4的乳酸溶液環境中，G3-PAMAM-COOH與含NACP粘接劑的聯合應用仍對牙本質仿生礦化有顯著效果，提示其有希望解決牙齒仿生礦化方面口干癥和放射性齲這類患者酸性唾液環境且缺乏鈣、磷離子的問題[29]。

Ge等[30]研究一種含有G3-PAMAM-NH2和甲基丙烯酸二甲氨基異丙酯的新型防齲粘接劑，實驗結果顯示其具有較強的抗菌性能和誘導牙本質仿生礦化的能力，意味著可以實現脫礦抑制和再礦化促進的雙重效果。

Xiao等[31]研制了一種包含NACP、甲基丙烯酸甲酯（dimethylaminohexadecyl methacrylate，DMADHM）、 2-甲基酰氧乙基磷酰膽堿（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC）和納米銀（silver nanoparticles，NAg）的生物活性多功能復合材料（簡稱BMC），其中DMADHM、MPC、NAg的添加顯著增強了材料的蛋白排斥及抗菌性能，將其與G3-PAMAM-NH2聯合應用實現了人牙根部牙本質在循環人工唾液/乳酸環境中最大程度的牙本質仿生礦化，且使其在21 d后恢復到與健康根部牙本質相當的硬度，提示BMC+PAMAM復合材料可作為治療根面齲Ⅴ類洞的修復手段。值得注意的是，牙本質表面快速的礦物沉積可能會導致一種超礦化現象，從而阻止礦物向牙本質管深層繼續沉積。

Vasile等[32]用琥珀酸端基的PAMAM制備了尺寸、大小穩定的金-樹枝狀納米復合材料，在模擬體液1.5倍加速礦化模型中驗證了該材料同樣具有誘導HAP形成的潛力。

盡管以上研究證明了PAMAM與其他無機材料結合引導再礦化的策略有良好的應用前景，然而水溶液中游離的樹狀大分子并不能促進晶體生長，為了實現牙體硬組織原位仿生礦化，必須提高PAMAM與牙硬組織基質（主要是HAP）之間的結合能力，且該能力可能會對控制晶體形態、尺寸產生積極影響[19]。Chen等[33]使用第7代PAMAM-COOH來探測納米棒狀的釉質的表面電荷陣列，用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）表征了枝狀體在晶體表面的分布情況，發現其沿c-軸方向且有規律的間隔（相距約45 nm）。采用蒙特卡羅方法模擬樹枝狀大分子與晶體表面的結合過程，計算樹狀大分子的-COOH基團與釉質晶體表面的結合強度，結果表明，釉質表面和生物蛋白質的電荷在二者結合中起重要作用。同樣的實驗條件下，氨基端的PAMAM比羧酸端的PAMAM與晶體表面結合能力更強。天然磷灰石的等電點為pH5.6[34]，因此研究假定釉質晶體在pH7.4環境中帶負電荷，解釋了帶正電荷的PAMAMNH2結合能力明顯強于PAMAM-COOH的原因，然而不能排除電荷分布圖案受到釉質晶體表面有機材料的某種影響，故仍需進一步研究。Wu等[35]合成了一種HAP錨定的胺丁羥磷酸鹽（alendronate，ALN）與PAMAM-COOH分子的復合物ALN-PAMAM-COOH，由于HAP與ALN的良好結合力，ALN-PAMAM-COOH能夠在人工唾液環境中對脫礦釉質表面進行原位仿生礦化，且大分子難以被磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗脫。不同于目前大多數牙體硬組織仿生礦化實驗在人工唾液/模擬體液培養條件下進行，Xie等[36]通過將大鼠脫礦牙本質樣本縫合到大鼠雙頰的方法，研究G3.5-PAMAM-COOH在大鼠唾液環境中誘導大鼠牙齒礦化的能力，結果表明G3.5-PAMAM-COOH能促進牙本質仿生礦化，且對牙本質小管有較明顯阻塞效果。

3 PAMAM的生物安全性研究

近年來牙體硬組織仿生礦化領域的研究表明：PAMAM無論是在礦化調控還是誘導晶體成核方面都具有一定的作用，這些作用與PAMAM的代數及表面基團等相關。但是，PAMAM的毒性也引起了關注。PAMAM作為納米藥物向環境中釋放，其濃度可能不斷增加，因此不可忽視對其生物學特性的研究。Oliveira等[37]用斑馬魚胚胎作為脊椎動物模型來評估PAMAM的毒性，結果表明G3、G4-PAMAMNH2在斑馬魚胚胎中有部分免疫反應，可能與其毒性有關，G3、G4-PAMAM的半數致死濃度分別為1.8和2.3 mg·L-1。學者[38]提出PAMAM的毒性可能與表面官能團逐代呈指數增長以及-NH2的濃度有關，為了避免PAMAM與細胞的直接接觸，可以通過化學蓋層的方法介導-NH2的細胞毒性作用（PAMAM的游離-NH2基團與乙酰氯發生反應，生成中性樹狀大分子），胺封蓋處理后的pamamm-g-diazirine粘接劑在小鼠體內毒性降低了一個數量級。此外，也有學者[39]提出樹狀大分子表面-NH2基團的正電荷與細胞膜脂質雙層帶負電荷組分間產生的靜電作用是影響樹狀大分子細胞毒性的重要因素，通過胺封蓋處理可以有效減少PAMAM-NH2與脂質雙層間的反應，從而提升PAMAM作為納米藥物的安全性。

盡管PAMAM及相關復合材料在牙體組織上進行仿生礦化的能力已被證實，然而有關PAMAM聚合物代數、表面基團、濃度及處理時間等因素的具體影響機制尚未有公認明確的解釋；再礦化層的物理和化學特性（顯微硬度、抗酸、抗力特性等）方面的研究也僅處于初期探索階段；PAMAM誘導仿生礦化的實驗大多是在開放環境中進行的，其在樹脂牙本質粘接界面微環境內是否具有相同的誘導脫礦牙本質仿生礦化的作用等，以上這些關鍵性問題的解決有賴于實驗手段的不斷提高和更多實驗數據的積累。PAMAM在牙科領域展現出發展前景的同時，也需要進行藥理學和毒理學篩選，只有通過不斷的研究才能正確評價PAMAM作為納米藥物的安全性，這一點對于臨床安全用藥具有重要意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。