代謝組學在胃癌研究中的應用進展

陶柱萍,李燦委,王雪雪,厲 穎,張成桂,3,劉衛紅,白 麗,高鵬飛,3*

(1.大理大學 藥學與化學學院,云南 大理 671000； 2.大理大學 公共衛生學院,云南 大理 671000；3.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室,云南 大理 671000； 4.大理大學 農學與生物科學學院,云南 大理 671000；5.大理大學 基礎醫學院,云南 大理 671000)

胃癌是五大常見癌癥之一,在全球癌癥死亡率排名中居第三位[1]。 中國胃癌的死亡人數約占全球胃癌死亡總數的47.8%,嚴重威脅人類健康[2]。胃癌早期手術治療后,患者5 年生存率為90%以上,而胃癌晚期5 年生存率僅為10%[3]。 胃癌的發生是一個多步驟、多因素的過程,其發病機制尚未完全明確,通常患者確診已是晚期[4-5]。 因此,對于胃癌的早期篩查、診斷、預后等,需要具有高靈敏度和特異性的生物標志物。

癌癥是一種代謝性疾病,代謝紊亂是癌癥發生、發展的關鍵事件,是癌癥的標志之一[6]。 代謝組學是對生物體中代謝物進行系統、定性和定量分析的一門學科,其研究對象聚焦于相對分子質量1000 以內的小分子物質,通過對某一生物體組分或細胞在一特定生理時期或條件下所有代謝產物的分析,尋找出差異代謝物,分析其改變的機制；可用于疾病早期診斷、藥物靶點發現、疾病機理研究等[7-8]。 隨著代謝組學技術的快速發展,現已廣泛應用于癌癥生物標志物的鑒定、監測以及抗癌藥物的研究。 本文總結歸納了近年來國內外代謝組學在胃癌研究中的相關文獻,為胃癌的研究提供參考。

1 代謝組學概述

1.1 代謝組學的概念及發展

1999 年,英國帝國理工學院的Nicholson 等[9]首次給出代謝組學的概念:病理生理刺激或基因改變引起的生物體動態多參數代謝應答的定量檢測；Fiehn 等[10]提出代謝組學是在某種環境下,特定生物樣品中所有小分子代謝物的定性、定量分析；Tang等[11]進一步完善代謝組學的概念為:“代謝組學是關于定量描述生物內源性代謝物質的整體及其對內因和外因變化應答規律的科學”。

1.2 樣本來源

基于代謝組學的研究方法,一般采用生物體液(尿液、血清、血漿)、組織(肝、腎、腦組織)或細胞等樣本作為研究對象。 尿液、血清等樣本的收集是非侵入性的,研究結果更適用于臨床研究,不足是尿液中的化合物比其它基質多,使得數據分析和生物學解釋更具有挑戰性。 肝、腎、腦組織樣本的收集具有入侵性,優點是對于疾病引起的組織受損,可通過對受損組織的檢測進一步明確其病理或治療機制。

1.3 檢測平臺

代謝組學檢測平臺有:核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR)、 氣 相 色 譜-質 譜(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)、液相色譜-質譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、超高效液相色譜-質譜(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)、超高效液相色譜-飛行時間質譜(ultraperformance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry,UPLC-TOF-MS)等[12-14]。 NMR 和MS是目前常用的代謝組學技術,也有研究采用多種代謝組學技術聯用[15],可以優勢互補,還可對研究結果進行相互驗證,提高實驗結果的準確性與重現性。

1.4 分析流程

代謝組學分析流程包括:樣品的收集與制備；數據采集；數據和生信分析,其中數據和生信分析是整個分析流程的關鍵。

數據和生信分析主要包括差異代謝物的鑒定、代謝通路分析等。 差異代謝物的鑒定常用的分析方法包括非監督性的主成分分析和監督性的偏最小二乘判別分析、正交偏最小二乘判別分析等；代謝通路分析常用的數據庫有人類代謝組數據庫(Human Metabolome Database,HMDB),京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG 等)[16-18]。

2 代謝組學在胃癌中的應用

2.1 研究對象及樣品

基于代謝組學對胃癌的研究包括體外[19](細胞)和體內[20-21](胃癌患者和動物模型)實驗,其中動物模型常采用SGC-7901 胃癌細胞進行造模。 樣品類型包括血液、尿液、組織和細胞提取物等。

2.2 代謝組學在胃癌早期診斷中的應用研究

近年來,許多學者基于代謝組學技術(1HNMR、LC-MS、GC-MS、UPLC-MS、LC-TOF-MS、UPLCTOF-MS 等)對胃癌進行研究,大部分采用患者樣本(血清、血漿、尿液、腫瘤組織)進行分析,發現了與胃癌早期診斷有關的多種潛在代謝生物標志物。

在胃癌患者或胃癌動物模型中上調的代謝物:乳 酸[3,21-23]、 谷 胱 甘 肽[3,23]、 氧 化 三 甲 胺(trimethylamine oxide,TMAO)[3]、纈氨酸[20,22-23]、腺嘌呤[20]、黃嘌呤核苷[21]、牛磺酸[21,24]、3-羥基丙酸[25]、鳥氨酸[26]、對稱二甲基精氨酸[13]、蛋氨酸亞砜[13]、苯乙酰谷氨酰胺[13-14]、犬尿氨酸[14]、亮氨酸[22]、2-氧戊二酸[24]、丙氨酸[24,27-28]、尿素[24]、尿酸[24]、苯乙酰甘氨酸[28]、甘露醇[28]、蔗糖[27]、丁酰肉堿[29]、肌苷[29]、異戊酰基肉堿[29]、蘇氨酸[29]。

在胃癌患者或者胃癌動物模型中下調的代謝物:瓜氨酸[3,23]、膽堿[3]、β -羥基丁酸[3]、色氨酸[13-14,21,26]、組氨酸[13,21-22,26]、谷氨酰胺[20-21,26]、富馬酸[20]、膽固醇[20]、脂肪酸[20]、十八烷基肉堿[13]、葡萄糖[21,23]、琥珀酸[22,24]、天冬氨酸[22,29]、甲硫氨酸[22]、十六烷酸[24]、馬尿酸[24]、嘧啶[24]、次黃嘌呤[28]、肌氨酸酐[27]、胞磷膽堿[29]、氧化谷胱甘肽[29]、黃嘌呤[29]、甜菜堿[23]、肌醇[23]。

這些生物標志物在胃癌早期預測、診斷中有重要意義,參與多個代謝通路,包括能量代謝(葡萄糖、乳酸、琥珀酸等)、氨基酸代謝(組氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等)、脂質代謝(膽固醇、膽堿)、核酸代謝(腺嘌呤、黃嘌呤核苷、肌苷等)、腸道微生物代謝(支鏈氨基酸(branched chain amino acids, BCAAs)、TMAO)等,部分生物標志物可能還與免疫(色氨酸)有關。

2.2.1 能量代謝

1956 年首次提出“Warburg 效應”,后續大量研究發現癌細胞會增加葡萄糖攝取,通過糖酵解獲得能量,以滿足維持其快速生長、增殖的能量需求[3,30]。 基于代謝組學研究發現,參與糖酵解的葡萄糖水平在胃癌患者和SGC-7901 荷瘤小鼠的組織和血漿中均呈下降趨勢,葡萄糖水平的降低可能是為腫瘤的生長、增殖提供能量,對胃癌的早期診斷有重要意義[21,23]。

基于代謝組學研究結果顯示,胃癌患者琥珀酸水平明顯下降,提示三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA 循環)代謝紊亂[22,27]。 乳酸是線粒體TCA 循環的底物,也是糖酵解的最終產物,能使腫瘤微環境呈酸性[31],促進腫瘤細胞在體內轉移和體外侵襲[5]。 乳酸積累也有助于促進血管生成,促進低氧誘導因子-1、激活核因子-κB 和磷脂酰肌醇-3-激酶信號在內皮細胞中的穩定,并誘導腫瘤相關基質細胞分泌血管內皮生長因子；乳酸水平的增加也刺激成纖維細胞產生透明質酸,這可能有助于腫瘤的侵襲[21]。 研究報道,乳酸在胃癌患者血漿、尿液以及胃癌組織中逐漸積累[3,21-23],提示與能量代謝相關的糖酵解和TCA 循環紊亂。 此外,丙酮酸也是參與TCA 循環和糖酵解的重要代謝物,丙酮酸代謝是細胞能量代謝的關鍵。 Ikeda 等[25]采用GC-MS分析發現,與健康對照者相比,胃癌患者血清中丙酮酸水平顯著下降,進一步表明胃癌患者的能量代謝紊亂。

以上實驗結果均證明胃癌患者的能量代謝紊亂,參與能量代謝的葡萄糖、乳酸、琥珀酸等可作為胃癌早期診斷的生物標志物。

2.2.2 氨基酸代謝

氨基酸是蛋白質結構中的基本單位,是嘌呤和嘧啶生物合成的前體,氨基酸代謝紊亂反映了癌細胞快速增殖的需要[3]。 在腫瘤代謝組學的研究中,多種氨基酸被認為有助于研究惡性腫瘤的潛在生物標志物[26]。

多位學者采用不同的代謝組學技術,研究發現胃癌患者及胃癌細胞荷瘤小鼠的血液、尿液、組織等樣品中參與氨基酸代謝的多種代謝物水平發生顯著性變化,其中組氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等部分氨基酸作為胃癌早期診斷的生物標志物[13,22-23,26,28-29]。

2.2.3 脂質代謝

脂質主要包括脂肪和類脂,脂質代謝紊亂可能影響腫瘤細胞的增殖、分化,加速癌癥的發生發展[21]。 Song 等[20]運用GC-MS 技術分析發現,胃癌患者血清中的膽固醇及部分脂肪酸水平顯著降低。提示胃癌細胞可能消耗大量脂肪酸以滿足細胞膜合成和能量產生的需求,導致血清脂肪酸的耗盡；此外,腫瘤細胞增殖與膽固醇的合成呈正相關,胃癌患者血清膽固醇的降低可能是大量膽固醇被用于生物膜的合成,血清膽固醇還可能被胃癌細胞獲取[20]。

膽堿是細胞生物膜的重要組成部分,在胃癌患者組織中膽堿的水平顯著降低[3,23],提示膽堿可能為腫瘤細胞的快速增殖提供合成細胞膜的成分。胃癌患者血清和組織中膽堿和膽固醇水平的下降可作為胃癌早期診斷的生物標志物[3,20,23],表明脂質代謝和細胞膜生物合成紊亂。

2.2.4 核苷酸代謝

腫瘤細胞的快速增殖和分化會導致核苷酸合成和分解代謝異常；核苷酸與能量代謝有關,主要以腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)和三磷酸鳥苷的形式存在,一些核苷酸類似物可以用作抗癌藥物,干擾核苷酸代謝[21]。 參與核苷酸代謝的化合物,如腺嘌呤、黃嘌呤核苷、肌苷等在胃癌患者或動物模型中增加,可作為胃癌早期診斷的生物標志物[20-21,29]。 此外,核苷酸分解代謝最終產物的積累以胃癌患者或動物模型中尿酸或尿酸鹽水平較高為特征。 研究報道,一些嘌呤化合物,如次黃嘌呤和鳥苷增加了胃癌患者尿液中尿素和尿酸積累,進一步表明胃癌患者核苷酸代謝異常[24]。 以上研究顯示,參與核苷酸代謝的腺嘌呤、次黃嘌呤等對于胃癌的早期診斷有重要意義。

肌苷參與ATP、蛋白質的合成以及核苷酸代謝,它能維持各種組織的能量平衡,并具有抗低氧作用,使處于低能缺氧狀態下的細胞恢復正常水平；此外,肌苷是一種天然抗氧化劑,可以減少活性氧的生成,保護DNA 免受活性氧物質誘導的氧化損傷[31]。 胃癌患者組織中肌苷水平的升高可能是機體早期的代償性反應。

2.2.5 腸道微生物代謝

胃腸道微生物群與消化系統疾病密切相關[32-33]。 腸道菌群在腸道內甚至腸道外組織的癌變以及抗腫瘤治療均有重要作用[34]。 胃癌微生物群可能減少微生物多樣性, 改變螺桿菌屬(Helicobacter)的豐度和部分腸道共生菌的富集[35]。Dong 等[36]采用16S rRNA 基因序列分析健康對照者和胃癌患者腸道微生物的變化,結果顯示,胃癌患者血清微生物α 多樣性降低,且有特定細菌。

BCAAs 來源于腸道微生物的轉化,其水平的變化被認為是反映宿主健康狀況和腸道微生物組成的 重 要 指 標[37]。 TMAO 是 由 三 甲 胺(trimethylamine,TMA)的前體膽堿通過腸道微生物和肝的聯合作用而形成的,TMAO 水平的變化與腸道微生物紊亂密切相關[38]。 有研究用代謝組學技術揭示了胃癌患者腸道微生物代謝紊亂,發現胃癌患者的支鏈氨基酸(BCAAs,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)和TMAO 水平均顯著升高,可作為胃癌早期診斷的生物標志物[3,22]。

2.2.6 免疫

免疫失調是宿主免疫系統逃避腫瘤的關鍵事件[13-14]。 胃癌的發生發展與免疫系統的變化密切相關,免疫療法可抑制腫瘤細胞增殖,在胃癌的治療方面取得了較好的效果[39-40]。

色氨酸是T 細胞增殖活化過程中的必需氨基酸,參與調節機體免疫系統的動態平衡[41]。 基于代謝組學的研究發現,胃癌患者的色氨酸水平較低[13-14,26],可能是色氨酸代謝酶吲哚胺2,3-雙加氧酶2 和色氨酸雙加氧酶的表達上調所致[13],這些酶不僅參與色氨酸代謝的調節,還在腫瘤免疫調節方面發揮重要作用。

2.3 代謝組學在胃癌手術治療后的應用研究

目前,臨床常用治療胃癌的方法是手術治療,Jung 等[28]對胃癌患者在手術治療前后的尿液代謝產物采用1H-NMR 檢測,研究其代謝物圖譜的差異。結果顯示,在手術治療7 d 后次黃嘌呤水平顯著升高,丙氨酸、精氨酸的水平顯著降低,提示次黃嘌呤、丙氨酸、精氨酸水平的變化可能作為胃癌術后改善的指標。

2.4 代謝組學在藥物治療胃癌后的應用研究

Kim 等[42]采用1H-NMR 代謝組學技術研究阿霉素治療AGS 荷瘤小鼠前后尿液中代謝物的變化,結果發現,TMA、TMAO、牛磺酸、3-吲哚硫酸鈉、馬尿酸、檸檬酸和2-酮戊二酸可作為增強阿霉素療效的治療指標,這些代謝物參與TCA 循環(檸檬酸和2-酮戊二酸)及腸道菌群代謝(TMA、TMAO、3-吲哚硫酸鈉)等代謝通路。

近年來,許多學者將治療胃癌的藥物集中于多途徑、多靶點、低毒副作用的中藥。 Ikeda 等[25]發現中藥復方改良四君子湯具有良好的抗腫瘤作用,可以增加裸鼠的體重,縮小腫瘤的體積。 此外,代謝組學結果表明,改良四君子湯可通過降低乳酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶及蛋白質水平,部分調節糖酵解(乳酸)、氨基酸(組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺)和脂質代謝(膽堿、甘油磷酸膽堿)紊亂。

3 總結與展望

代謝組學在胃癌研究中展現出了巨大的發展潛力,特別是在胃癌的早期診斷及預后等方面具有廣泛的研究前景和臨床應用價值。

目前,基于代謝組學技術發現了多種胃癌的內源性代謝生物標志物,這些生物標志物涉及能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、核苷酸代謝、腸道微生物代謝等,可用于胃癌早期診斷,并延伸到手術、藥物治療胃癌的研究；而且,目前基于代謝組學對胃癌的研究大多以胃癌患者為研究對象,結果更具有臨床指導價值。

但目前的相關研究仍存在許多有待提高的方面,如已報道的潛在生物標志物,存在相反的變化趨勢的現象,如絲氨酸[3,22]、酪氨酸[3,21,23,28]、谷氨酸[21,29]、丙酮酸[23,25]、檸檬酸[22,24,27]、脯氨酸[24,29]、蘋果酸[22,24]、甘氨酸[23-24]、精氨酸[22,26,28],這可能是由于研究對象、檢測樣本、檢測技術等的不同導致,需進一步研究。 如何從整體的角度,探索不同研究對象、檢測樣本、檢測技術產生的差異和內在聯系,是胃癌生物標志物研究面臨的一個挑戰。 其次,規范樣品的處理方法,聯合使用多種代謝組學技術以提高實驗結果的準確性與重現性,值得進一步探討。 此外,代謝組學分析較為復雜,后續可考慮研發、檢測已確定生物標志物的試劑盒,為胃癌早期診斷、預后等提供更便捷、準確的方法。

目前基于代謝組學研究胃癌的樣品主要有血液、尿液、組織樣品等,但血液和組織樣品的收集具有侵入性,非入侵性的尿液樣本數據分析和生物解釋具有挑戰性。 后續的實驗也可考慮分析唾液等樣本的代謝物變化尋找其生物標志物。

代謝組學可動態檢測生物樣品代謝譜的變化,但現有的研究大多只收集單個時間點的樣品進行分析。 今后可考慮設置多個時間點收集樣品,進行代謝物的動態分析,從而進行更全面的代謝物分析,探索胃癌的發生發展及預后的動態變化過程。