懷山藥內生真菌產3-吲哚乙酸能力檢測

劉 元 ，劉 淼，阮 元，張少寧，王旭光，文春南，麻兵繼，*

（1.河南農業大學中藥材系，河南 鄭州 450002；2.河南白云牧港生物有限公司，河南 登封 452470）

植物內生真菌在長時間的進化過程中和宿主植物建立了共生關系，不僅能獨立產生豐富的次生代謝產物，而且還能參與宿主植物的代謝過程，對植物的生長發育、抗病抗逆、有效成分的產生和積累起到促進作用［1］。山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的根莖［2］。古河南懷慶府地區（今博愛、武陟、溫縣）所產山藥最佳，故謂之“懷山藥”，為著名的四大懷藥之一［3］，也是我國傳統的藥食同源品種之一。文獻報道懷山藥中含有薯蕷皂苷、尿囊素、膽堿、糖蛋白、自由氨基酸、山藥堿、山藥多糖等多種成分［4-5］，具有健脾益胃、生津益肺、補腎澀精等功效，素有“懷參”之譽。

目前，對懷山藥內生真菌的研究較少。本課題組前期采用高通量測序技術，測定了懷山藥根、莖中主要內生真菌分布。其中優勢內生真菌有鏈格孢屬（根17.1%、莖33.2%），葡萄孢盤菌屬（根34.1%、莖6.3%），毛球殼屬（根20.0%、莖0.3%）［6］。本課題組通過傳統的分離方式從懷山藥的根、莖中純化獲得了38 株可培養的內生真菌［7］。文獻報道植物內生真菌對宿主植物具有促生長作用［8］，3-吲哚乙酸是人們最早發現的植物生長激素，可調控植物細胞的分裂、伸長、分化、根原基發生及胚的形成過程［9］。為深入研究內生真菌與懷山藥的共生關系，本實驗對前期分離得到的38 株懷山藥內生真菌進行產生長激素3-吲哚乙酸的篩選，并以PDB（馬鈴薯葡萄糖肉湯液體培養基）、SDB（沙氏液體培養基）、SNB（合成低營養液體培養基）、MB（麥芽浸汁液體培養基）4 種不同培養基考察陽性菌株分泌3-吲哚乙酸的能力，進而借助HPLC 測定其最大分泌量，旨在發現對懷山藥促生作用明顯的菌株。

1 材料

1.1 供試菌株 懷山藥的根、莖中分離得到的38 株內生真菌。

1.2 供試培養基 PDB 培養基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SDB培養基，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。SNB 培養基，KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO40.5 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，加蒸餾水至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。MB 培養基，麥芽浸膏25 g，蒸餾水1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器 LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；QHZ-98 A 全溫震蕩搖床（太倉市華美生化儀器廠）；GXZ 型多段編程智能光照培養箱（寧波江南儀器廠）；RE-2000A 旋轉蒸發器（鄭州予華儀器制造有限公司）；Waters 1525 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；分析天平（萬分之一，上海菁海儀器有限公司）。

1.4 試劑 Salkowski 試劑，稱取FeCl312 g，溶于500 mL蒸餾水中，然后緩慢加入430 mL 98% H2SO4，冷卻后定容至1 L，配置成標準比色液（測定范圍為 0.3～20 mg/L）［10］。乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；乙腈（一級色譜純，天津市四友精細化學品有限公司）。

2 方法與結果

2.1 篩選懷山藥內生真菌分泌3-吲哚乙酸 將38 株真菌接種到150 mL PDB 液體培養基上進行培養（250 mL 錐形瓶，30 ℃，120 r/min）8 d，用移液槍吸取200 μL 發酵液置白色坩堝內。1∶1 加入標準比色液，在暗處靜置30 min后，觀察其顏色變化，同時以空白PDB 培養液為對照。以200 μL 3-吲哚乙酸標準液（0.9 mg/L）加等量標準比色液作為陽性對照液，進行顏色比較。經過篩選發現1 株內生真菌LY-22 具有顯著陽性顏色反應，并經分子生物學手段鑒定為鐮刀屬真菌銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum。

2.2 銳頂鐮刀菌在4 種培養基的發酵液中分泌3-吲哚乙酸測定

2.2.1 樣品溶液制備 將銳頂鐮刀菌分別在PDB、SDB、MA、SNB 4 種培養基液體中培養14 d（120 r/min，30 ℃），每種培養基同一批次共發酵21 瓶。每隔2 d 取其中3 瓶，以抽濾法分離菌液和菌絲，以乙酸乙酯和菌液1∶1進行萃取，共萃取3 次。將乙酸乙酯萃取液合并，濃縮蒸干后，用色譜級甲醇定容至3 mL。

2.2.2 3-吲哚乙酸對照品溶液制備 用天平準確稱取4.50 mg 3-吲哚乙酸對照品，以色譜甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，制備成0.090 mg/mL 的3-吲哚乙酸甲醇溶液。

2.2.3 色譜條件 Venusil ASB -C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水-乙腈（65∶35）；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。在此條件下，樣品中的3-吲哚乙酸與其他色譜峰能較好的分離，見圖1。

2.2.4 精密度試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，重復進樣5 次，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.80%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 取同一對照品溶液15 μL，在“2.2.3”項色譜條件下，分別于0、1、3、5、7 h 進樣，測得3-吲哚乙酸峰面積RSD 為0.97%，表明溶液在7 h 內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗 取相同條件下的PDB 發酵液3 份，按“2.2.1”項下方法制備樣品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，進樣15 μL，測定3-吲哚乙酸的峰面積，按外標法計算含有量，RSD 為1.30%，表明該方法重現性良好。

2.2.7 線性關系考察 取“2.2.2”項下對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下，分別進樣2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 μL 測得3-吲哚乙酸峰面積，以對照品體積為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝185 371X-29 488（r＝0.999 6），表明線性關系良好。

2.2.8 4 種液體培養基中3-吲哚乙酸測定 銳頂鐮刀菌在4 種液體培養基的發酵培養期間每隔2 d 測其發酵液中的3-吲哚乙酸含有量，測定結果表明在第10 天左右生長激素分泌量達到最高值并基本保持平穩，且在PDB 液體發酵液中產出量最高（經HPLC 測定，該真菌在PDB 液體發酵液中分泌3-吲哚乙酸的量約為1.80 mg/L），SDB 液體發酵液中含有量次之，但未在SNB 發酵液中檢測到3-吲哚乙酸的存在，見圖2。

3 結論與討論

本研究從懷山藥中分離得到的38 株內生真菌中經篩選發現1 株內生真菌銳頂鐮刀菌具有顯著分泌生長激素3-吲哚乙酸的能力。利用PDB、SDB、SNB、MB 4 種不同培養基對銳頂鐮刀菌進行液體培養，測定該真菌分泌3-吲哚乙酸的能力，結果表明銳頂鐮刀菌在PDB 培養基中發酵10 d左右，菌液中的 3-吲哚乙酸產量達到最高值，約為1.80 mg/L。

近年來在很多植物中，內生真菌對宿主有促生作用的報道。張春英等［11］研究發現盆栽杜鵑根部接種樹粉孢屬真菌菌株，對盆栽杜鵑花的生長具有明顯的促進作用。陳志為等［12］將臺灣相思樹的不同優勢內生真菌組合澆根回接于幼苗，發現對幼苗所測各項生理指標均顯示促進作用。懷山藥作為河南的道地藥材之一，具有悠久的栽培歷史，藥材產地具有明顯的地域性，但至今鮮有報道內生真菌對其具有促生作用。3-吲哚乙酸最明顯的生態作用是促進植物生長，但對植物莖、芽、根不同部位生長的促進作用因濃度而異。在細胞水平上，3-吲哚乙酸可刺激形成植物層細胞分裂；刺激枝的細胞伸長、抑制根細胞生長；促進木質部、韌皮部細胞分化，促進插條發根、調節愈傷組織的形態建成；在器官和整株水平上，3-吲哚乙酸從幼苗到果實成熟都起作用［13-14］。本實驗在懷山藥中首次篩選得到具有產3-吲哚乙酸能力的內生真菌銳頂鐮刀菌，但該內生真菌是否對懷山藥植株的生長具有促進作用仍需要將菌種回接試驗來驗證，其具體的促生機制值得進一步深入研究。后續實驗結果若表明3-吲哚乙酸對懷山藥大田栽培的確發揮了明顯的促生長作用，將來可開發成生物生長調節劑應用于懷山藥的生產實踐。