發(fā)酵染菌的前兆及處理方法

徐煥文（河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司. 河北省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊051430）

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物發(fā)酵的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，從早期的發(fā)酵生產(chǎn)酒精到近百年前生產(chǎn)丙丁溶劑，再到現(xiàn)代的青霉素、潔霉素以及阿維菌素等等。產(chǎn)品不僅有基礎(chǔ)化工產(chǎn)品，還有人藥、獸藥和農(nóng)藥等。在發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中程度不同的都存在染菌現(xiàn)象，同樣也存在怎么發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，怎么把染菌后的損失降到最低等問(wèn)題，本文結(jié)合某公司丙丁溶劑的生產(chǎn)進(jìn)行說(shuō)明。

1 染菌的原因以及對(duì)無(wú)菌概念的新認(rèn)識(shí)

1.1 染菌的原因介紹

染菌的原因有培養(yǎng)基的消毒、無(wú)菌空氣的質(zhì)量、種子罐和發(fā)酵罐的閥門汽封情況、物料系統(tǒng)泄漏、冷卻系統(tǒng)泄漏、操作失誤等很多因素；染菌的種類也由于不同的裝置、不同的地區(qū)和不同的環(huán)境，有桿菌、球菌和其他雜菌[1］。往往一套裝置總是習(xí)慣性的染某一種菌，這和人員操作、設(shè)備情況、使用原料、環(huán)境情況等都有直接關(guān)系。

1.2 對(duì)無(wú)菌概念的新認(rèn)識(shí)

筆者認(rèn)為對(duì)無(wú)菌的概念應(yīng)該有一個(gè)新的認(rèn)識(shí)，無(wú)菌是相對(duì)的，絕對(duì)的無(wú)菌是做不到的。主菌種生長(zhǎng)旺盛時(shí)，雜菌處于劣勢(shì)位置顯現(xiàn)不出來(lái)；一旦主菌種有問(wèn)題，雜菌很快就會(huì)成長(zhǎng)起來(lái)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。一個(gè)發(fā)酵周期就是主菌種與雜菌的博弈過(guò)程；生產(chǎn)過(guò)程的控制就是提供有利于主菌種生長(zhǎng)的各種條件，采取抑制雜菌生長(zhǎng)的各種措施。

2 裝置的正常運(yùn)行指標(biāo)

某套連續(xù)發(fā)酵的丙丁溶劑生產(chǎn)裝置，6個(gè)種子罐、2個(gè)育種罐、2 個(gè)一級(jí)罐、4 個(gè)后發(fā)酵罐。培養(yǎng)基的糖濃度在4.8%～5.5%，正常情況下培養(yǎng)基的打料速度控制在90～100m3/h。育種罐發(fā)酵醪液菌種活力（次甲基藍(lán)退色時(shí)間，下同）2min～20s，前發(fā)酵期的酸度4.5～6.5，罐糖小于2%；一級(jí)罐發(fā)酵醪液菌種活力20s～2min，主發(fā)酵期的酸度6.5～4.5，罐糖小于1.5%；末級(jí)發(fā)酵罐的酸度正常情況較低在3.0～1.5［2］，殘?zhí)切∮?.4%，菌種已經(jīng)沒(méi)有活力或活力非常小。生產(chǎn)正常運(yùn)行時(shí)，一個(gè)檢測(cè)周期為2 h。

3 染菌的前兆及處理方法

大生產(chǎn)中用顯微鏡做鏡檢是判斷發(fā)酵染菌與否的重要手段。可是這種判斷往往滯后，只有雜菌數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)鏡檢才能做比較明確的判斷。筆者總結(jié)了大裝置發(fā)酵生產(chǎn)的運(yùn)行數(shù)據(jù)，認(rèn)為通過(guò)觀察各級(jí)罐的降糖情況、酸度升降情況、種子活力的變化情況等生產(chǎn)運(yùn)行指標(biāo)能發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，再結(jié)合鏡檢能對(duì)發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象做出及時(shí)的判斷，以便采取正確的處理方法。

3.1 根據(jù)各級(jí)罐的降糖情況判斷染菌的前兆及其處理方法

（1）由各級(jí)罐的降糖情況觀察，正常情況下糖度應(yīng)該是育種罐小于2%，一級(jí)罐小于1.5%，末級(jí)罐小于0.4%，呈階梯形狀下降。如果一級(jí)罐的罐糖連續(xù)幾個(gè)檢測(cè)周期都超過(guò)1.5%，導(dǎo)致末級(jí)罐大于0.5%甚至更高，說(shuō)明菌種的耗糖能力已經(jīng)下降也就是活力已經(jīng)下降，這時(shí)從鏡檢和種子活力的檢測(cè)上觀察的表現(xiàn)也并不一定明顯。首先采取的措施是減少蒸煮醪1/3 的進(jìn)醪量，12 h 之后觀察育種罐和一級(jí)罐的罐糖是否恢復(fù)正常？24 h之后觀察前2個(gè)發(fā)酵罐的罐糖是否正常？36 h之后再觀察從育種罐到發(fā)酵罐的各級(jí)罐糖是否恢復(fù)到呈階梯形狀下降？如果恢復(fù)到了正常指標(biāo)，運(yùn)行一定時(shí)間后就逐漸提高進(jìn)醪量，恢復(fù)正常生產(chǎn)。

（2）采取措施12 h 后所觀察的效果扔不明顯，就有可能是菌種活力已減弱，雜菌抑制了丙丁菌的生長(zhǎng)，這就是染菌的前兆。應(yīng)結(jié)合顯微鏡的觀察和種子活力的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行判斷，最后確定染菌情況。這時(shí)不應(yīng)該再報(bào)僥幸心理，確定后應(yīng)立即采取3.4的措施。

3.2 根據(jù)各級(jí)罐的酸度變化來(lái)判斷染菌的前兆及其處理方法

育種罐是前發(fā)酵期，是升酸期，升到6.5是正常的。一級(jí)罐及之后是主發(fā)酵期和后發(fā)酵期，是降酸期；一級(jí)罐到末級(jí)罐的酸度應(yīng)該從6.5降到3左右，甚至達(dá)到1.5以下也是正常的。

（1）如果育種罐和一級(jí)罐的酸度達(dá)到了7以上，并且后面的罐降酸現(xiàn)象不明顯，說(shuō)明育種罐或種子罐已經(jīng)染菌，應(yīng)馬上停止進(jìn)培養(yǎng)基采取3.4的措施。

（2）如果育種罐和一級(jí)罐的酸度正常，末級(jí)或其前一個(gè)罐的酸度超過(guò)5，說(shuō)明后面幾個(gè)發(fā)酵罐已經(jīng)染菌的可能性非常大，這時(shí)應(yīng)采取一級(jí)罐后“隔斷”措施來(lái)進(jìn)行補(bǔ)救。所謂“隔斷”措施就是：將一級(jí)罐后的第一個(gè)和第二個(gè)罐進(jìn)行清空、消毒之后再進(jìn)料的處理方法，如果此方法沒(méi)有效果說(shuō)明雜菌是從前面帶來(lái)的，仍要采取3.4的措施。

3.3 根據(jù)各級(jí)罐菌種活力的變化來(lái)判斷染菌的前兆及其處理方法

首先，觀察育種罐的菌種活力情況。育種罐從補(bǔ)充培養(yǎng)基開始到移到移種一級(jí)罐，這1 個(gè)周期一般不超過(guò)3 個(gè)次檢測(cè)周期。這3個(gè)檢測(cè)周期的活力應(yīng)該是從弱到強(qiáng)，次甲基藍(lán)退色時(shí)間從幾十分鐘或幾分鐘，再到幾十秒甚至幾秒。如果育種罐的一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)的幾次檢測(cè)活力都在幾分鐘以上說(shuō)明菌種活力變差，應(yīng)該采用多留種少補(bǔ)培養(yǎng)基的辦法來(lái)調(diào)整菌種活力；如果采取措施后仍沒(méi)有效果，連續(xù)一到兩天菌種活力都是幾分鐘以上，應(yīng)該是育種罐染菌的前兆。雜菌來(lái)自本育種罐或者是種子罐，確認(rèn)后應(yīng)該采取3.4的處理措施。

其次，觀察一級(jí)罐的菌種活力情況。一級(jí)罐里發(fā)酵的這段時(shí)間是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的主發(fā)酵期，也是菌種生長(zhǎng)最旺盛、活力最強(qiáng)的時(shí)期。菌種活力正常都是幾十秒，最長(zhǎng)也不超過(guò)2min，如果連續(xù)幾個(gè)檢測(cè)周期菌種活力都大于2min，應(yīng)該是一級(jí)罐染菌的前兆。雜菌來(lái)自本一級(jí)罐或者是育種罐，確認(rèn)后應(yīng)該采取3.4的處理措施。

第三，觀察后發(fā)酵期發(fā)酵罐的菌種活力情況。五號(hào)罐后一直到末級(jí)罐菌種的活力逐漸減弱，從幾十秒到幾分鐘，末級(jí)罐基本上檢測(cè)不到活力。這段時(shí)間由于菌種活力逐漸減弱，也是極易染菌的時(shí)段。如果五號(hào)罐連續(xù)幾個(gè)檢測(cè)周期的活力都變長(zhǎng)，超過(guò)了2min甚至更長(zhǎng)，后面幾個(gè)罐的酸度或罐糖也升了起來(lái)，就是后發(fā)酵期染菌的前兆。采取3.2.(2)的處理方法，沒(méi)有效果后應(yīng)果斷采取3.4的處理措施。

3.4 確定染菌后的處理方法

如果確定是一級(jí)罐之前的發(fā)酵罐或種子罐發(fā)生了染菌現(xiàn)象，或者是五號(hào)罐之后出現(xiàn)染菌前兆采取3.2.(2)的方法處理后沒(méi)有作用，就應(yīng)該將本條線徹底清空，進(jìn)行消毒處理。①停止進(jìn)培養(yǎng)基，從蒸煮系統(tǒng)開始整個(gè)物料系統(tǒng)按照走料順序依次消毒。②用無(wú)菌空氣從種子罐開始往后壓料，根據(jù)后發(fā)酵罐的酸度、糖度以及溶劑含量的變化情況來(lái)決定壓料速度，原則上是盡快把染菌發(fā)酵液處理完。爭(zhēng)取在酸度基本沒(méi)有升高、溶劑含量沒(méi)有下降的情況下將發(fā)酵液依次壓入成熟醪罐盡快蒸餾，試想一條發(fā)酵線有2500m3發(fā)酵醪液，溶劑含量從初始的1.8 g/100 mL降到壓完料時(shí)的1.6g/100 mL，只是損失了約2.5t的溶劑；如果沒(méi)有采取措施，壓完料時(shí)降到了0.5 g/100 mL，實(shí)際上損失了約16.25t 的溶劑。③從種子罐到所有的發(fā)酵罐依次全部進(jìn)行消毒處理，包括罐體內(nèi)部、物料管線、移種管線、汽封閥門等。④空氣系統(tǒng)進(jìn)行消毒，包括過(guò)濾器、濾芯、空氣管線等。

4 結(jié)語(yǔ)

大裝置的發(fā)酵生產(chǎn)中，“染菌”是一個(gè)繞不開的話題，也是一個(gè)很難杜絕的現(xiàn)象。我們除了加強(qiáng)檢查、加強(qiáng)操作、定期的對(duì)設(shè)備和環(huán)境來(lái)進(jìn)行消毒等管理措施以盡量減少染菌次數(shù)外；再就是通過(guò)上述方法發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，采取合適的處理方法將染菌后的損失降到最低。

文章是根據(jù)使用上海生命科學(xué)院代號(hào)為2018菌種，丙丁溶劑連續(xù)發(fā)酵來(lái)做的總結(jié)，間歇發(fā)酵及其他產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)也自然有其本身的規(guī)律。