胸腺上皮細胞自噬在T細胞分化發育中的研究進展①

邢君娜 王金麗 何新新 劉 婷 李 彬

(河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000)

胸腺作為哺乳動物重要的中樞免疫調節器官，是T細胞分化發育成熟的主要部位，并可分泌多種胸腺激素及激素類物質[1]。胸腺為T細胞分化發育提供了最適宜的微環境,胸腺微環境主要由胸腺基質細胞(thymic stromal cells,TSCs)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)和細胞因子組成。其中胸腺基質細胞類型較多，包括胸腺上皮細胞(Thymic epithelial cells，TECs)、樹突狀細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等，其中TECs是胸腺微環境中最重要的成分，通過細胞與細胞間的相互作用及分泌一些可溶性分子影響不同發育階段的胸腺細胞發育成熟[2]。TECs根據其在胸腺中位置不同，分為分布在胸腺外側皮質的皮質胸腺上皮細胞(cortical thymic epithelial cells，cTECs)和分布在髓質的髓質胸腺上皮細胞(medullary thymic epithelial cells，mTECs)，胸腺細胞的發育和成熟是通過在胸腺皮質和髓質上皮細胞的遷移過程中相互作用完成的[3]。近期研究表明，相比大多數其他組織，TECs具有異常高的自噬體的數量。自噬的遺傳干預,尤其是在TECs，會改變 T細胞特異性選擇，導致嚴重的大腸炎與多器官炎癥[4]。本文就胸腺上皮細胞內自噬在如何影響T細胞在胸腺內成熟作一綜述。

1 自噬及其分子機制

自噬是一種由溶酶體介導的，通過對細胞質成分、細胞器降解和再循環，維持細胞內環境穩定的過程[5]。由于自噬是幾乎所有類型細胞維持其穩態所需的基本過程，所以細胞內均保持基礎水平的自噬[6]。除此之外，自噬對于細胞在饑餓、活化、生長和增殖等應激條件下至關重要，為細胞提供必需的代謝中間體。這些基本的自噬功能與疾病和衰老有關，因為聚集的蛋白質，受損的細胞器或其他分子的積累是許多疾病的潛在問題。例如，自噬涉及克羅恩病、腫瘤、衰老和囊性纖維化等神經退行性疾病，以及代謝相關疾病[7-9]。此外，自噬可以直接降解入侵病原體(異種自噬)，從而起到細胞自主免疫的作用[10]。自噬有三種不同類型，即分子伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬。其中巨自噬是最獨特的，因為它在胞質裝載過程中形成了雙膜結構，即自噬小體[11]。此外，也是研究最深入的自噬類型，并且由于這篇綜述涉及巨自噬，它將在下文中簡稱為“自噬”。

自噬的過程由成核、延伸、融合和降解四個不同的階段組成，降解的氨基酸等小分子物質釋放回細胞質以提供細胞的代謝功能[12]。自噬相關基因(autophagy relative gene，Atg)依次參與組裝并被錨定在雙層膜上來識別吞噬復合物，這最終導致吞噬復合物與細胞液隔離。到目前為止，在酵母中已有36個Atg蛋白質被確定,形成自噬過程中不同的功能復合物[13]。自噬起始時，由UNC-51樣激酶1(ULK1)、200KDaFAK家族交叉蛋白(FIP200)和mATG101組成的ULK1復合物被募集到杯狀隔離膜的組裝位點上，ULK1復合物通過去磷酸化被激活后，開啟自噬通路[14]。磷脂酰肌醇3-羥基激酶(PI3K，也稱為hVsp34)復合物由hVsp34、p150、Beclin1和 Atg14L組成，有助于磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)產生，提供脂質信號并招募其他自噬效應器到吞噬泡促進自噬的形成，如雙FYVE域蛋白(DFCP1)和WD重復蛋白與磷酸肌醇(WIPI)家族成員相互作用[15]。杯狀隔離膜成核后，兩種泛素樣結合系統：Atg12-Atg5和微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)-磷脂酰乙醇胺(PE)途徑，在自噬的延伸及閉合中發揮重要作用。在Atg12-Atg5途徑中，Atg7(E1泛素活化酶)活化后轉移至Atg10(E2泛素綴合酶)，Atg12與Atg5的內部賴氨酸(底物蛋白)共價結合，形成Atg12-Atg5復合物，其進一步與Atg16L相互作用形成Atg12-Atg5-Atg16L復合體[16]。在LC3-PE途徑中，LC3由Atg4(一種半胱氨酸蛋白酶)處理以暴露一種C-末端甘氨酸殘基，形成LC3I。然后，LC3I被激活并由Atg7轉移到Atg3(E2泛素結合酶)形成LC3I-Atg3復合物。最后，LC3I與PE共軛，形成LC3II-PE復合物，其在自噬體的形成及中必不可少[17]。在自噬小體形成后，自噬小體被運輸到溶酶體并與其融合，形成自噬溶酶體，溶酶體內的一系列酸性水解酶將其內容物降解，并釋放到細胞質中被重新利用。該過程由溶酶體相關膜蛋白2(LAMP-2)、Rab7、紫外線輻射抗性相關基因(UVRAG)、ANARE和運輸所需的內體分選復合物(ESCRT)介導[18]。

2 T細胞在胸腺內分化發育的階段

T細胞在胸腺內發育是一個復雜的過程。T細胞的選擇和成熟受胸腺細胞與胸腺皮質和髓質TECs之間的相互作用及其分泌的細胞因子調控[19,20]。主要是通過產生特異性T細胞受體(T cell receptor，TCR)并通過識別自身抗原，形成自身耐受性T細胞，從胸腺輸出到外周的過程[21]。胸腺細胞作為T細胞的前身細胞在胸腺內的分化發育是一個連續的過程，大體上可以分為三個階段：①雙陰性細胞(Double negative，DN)階段：來自骨髓的淋巴干細胞遷移至被膜下區，位于此區的胸腺細胞為CD4-CD8-雙陰性細胞[22]。②雙陽性細胞(double positive，DP)階段：首先，根據CD25和CD44可進一步區分CD4-CD8-雙陰性細胞的分化程度：CD44+CD25-(DN1)→CD 44+CD25+(DN2)→CD44-CD25+(DN3)→CD44-CD25-(DN4)[23]，其中Tcrb，Tcrg和Tcrd(分別編碼TCRβ，TCRγ和TCRδ鏈)基因位點的重排開始于DN2階段并在DN3階段完成[24]。而Tcrb重排對于大多數胸腺細胞向αβT細胞譜系分化至關重要。不能產生TCRβ鏈的胸腺細胞不能進一步成熟并發生凋亡。通過功能性TCRβ鏈表達啟動的過程被稱為β選擇。它涉及新生TCRβ鏈與恒定的pre-Tα(pTα)鏈配對形成pre-TCR過程，為DN4和DP階段的存活和進展提供必需信號[25]。β選擇涉及大約5輪的增殖，在此期間，胸腺細胞下調CD25的表達成為DN4細胞，然后迅速上調CD4和CD8。分化為成熟的CD4+CD8+雙陽性細胞[26]。③單陽性細胞(single positive，SP)階段：雙陽性細胞在受到cTECs呈遞的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)肽復合物時激活，并進一步誘導分化為SP階段。在這個階段中，與MHC-Ⅰ分子識別的形成CD8SP細胞，與MHC-Ⅱ分子識別的成為CD4SP細胞。從而進一步分化發育為只表達CD4+或CD8+的單陽性細胞[27]。

3 自噬與T細胞分化發育過程

胸腺細胞的成熟過程實質上是一種選擇過程，主要包括cTECs中的陽性選擇過程和mTECs中的陰性選擇過程[28]。陽性選擇是指在胸腺皮質的cTECs中，T細胞表面表達的TCR能和自身MHC識別的T細胞被允許增殖、分化、發育成為成熟T細胞的過程，使其具有自身MHC限制性。也就是雙陽性胸腺細胞發育成熟為單陽性胸腺細胞的過程[29]。通常，MHC-Ⅰ類分子提呈細胞內抗原給CD8+T細胞，MHC-Ⅱ類分子提呈細胞外抗原給CD4+細胞[30]。陰性選擇是指在胸腺髓質mTECs中，對自身抗原應答而不能識別異體抗原的單陽性胸腺細胞發生克隆缺失，即賦予其自身耐受性[31]。

研究表明，TECs是唯一的非造血細胞組成性表達MHC分子[32]，與專業的APC相比，其在捕獲和處理細胞外抗原的功能較弱[33]，表明了MHC提呈過程中可能的細胞內替代途徑。內源性加載MHC分子的候選途徑可能是TAP依賴途徑、分子伴侶介導的自噬及巨自噬[34]。其中，巨自噬被證明在其抗原提呈過程中可以與MHC相交叉，即細胞內抗原被吞噬后，自噬小體與MHC區室而不是溶酶體相融合，從而提呈抗原表位[35]。且用綠色熒光蛋白(GFP)-LC3轉基因小鼠研究中發現，TECs具有強烈的饑餓獨立的自噬活性。而在許多其他組織中，如肌肉等，僅在饑餓時自噬才被誘導并被檢測到[36]。表明TECs中自噬對胸腺內T細胞選擇中抗原呈遞過程中不可或缺。

3.1自噬與T細胞的陽性選擇過程 胸腺皮質內T細胞陽性選擇過程是胸腺細胞表面形成的TCR與自身MHC識別的過程。能與自身MHC識別的胸腺細胞允許其克隆增殖，否則將發生凋亡[25]。通過自噬體標記物LC3與胸腺冷凍切片中的H2-DM陽性區室共定位，獲得了功能性證據證明了TECs中自噬的關鍵作用是產生陽性選擇肽/MHC-II類配體[37]。因此，胸腺細胞TCR配體的形成對于其陽性選擇過程有著微弱的作用。此外，為了檢測自噬在T細胞選擇中的作用，將Atg5-/-或野生型小鼠胸腺移植到成年野生型小鼠，發現Atg5缺陷小鼠與野生型小鼠相比胸腺細胞數量發生了明顯變化。而對其TECs中MHC分子的表達水平進行檢測發現，MHC-Ⅰ類分子的表達正常而MHC-Ⅱ分子表達水平有輕微的降低。為進一步驗證，通過對幾種MHC-Ⅱ限制性轉基因小鼠自噬干預，表明HA-TCR受體、SEP-TCR的血凝素和同源肽的呈遞通過自噬促進，而通過AND和DEP TCR識別的同源肽的加載均未通過自噬促進。除此之外，DO11.10 TCR特異性肽加載甚至似乎被自噬負調控。同時，對MHC-Ⅰ限制性轉基因TCR研究中發現，自噬的缺失對其配體的形成無明顯影響[38]。這些結果支持自噬和其他MHC加載途徑在陽性選擇期間通過促進特定肽的呈遞來影響T細胞庫形成過程的假設。

為了證明自噬確實能夠模擬MHC-Ⅱ配體的組成，考慮到體外分離的TECs數量有限，不能進行MHC配體的全面評估，應用B-淋巴母細胞系在自噬存在或缺失時對MHC-Ⅱ結合肽進行質譜分析[39]。為了觀察cTECs上特定的MHC-Ⅱ類結合肽是否受到自噬的遺傳干擾的影響，研究中使用了一種單克隆抗體(Y-Ae)，它在被I-Ea來源的肽占據時識別I-Ab。通過對IE和IA分子的共分選，I-Ea52-68-I-Ab復合物在造血抗原呈遞細胞上(占所有I-Ab-肽復合物的10%)富集[40]。值得注意的是，這種復合物在cTEC上的代表性相對較低，并且假設這是由于cTEC以其特異性方式表達和/或處理的肽競爭結合I-Ab。當分析來自F1(BALB/c×C57BL/6)Atg5-/-的cTECs時，發現與野生型對照相比I-Ea52-68-I-Ab復合物富集增加，而總MHC-Ⅱ水平卻相反[38]。這些發現提供了Atg5缺陷引起cTECs的MHC-Ⅱ配體的定量轉變的直接證據，進一步表明cTECs中I-Ea52-68-I-Ab復合物的增加與自噬缺失引起的MHC-Ⅱ類結合肽降低，從而引起與I-Ab競爭結合減弱。

3.2自噬與T細胞的陰性選擇過程 自噬除了在陽性選擇中的作用之外，在mTECs中組織限制性抗原(tissue-restricted antigens，TRAs)呈遞的陰性選擇過程中的功能是有爭議的[41]。盡管在正常條件下，研究顯示cTECs和mTECs中LC3表達在后者中程度較低，且通過LC3和MHC-Ⅱ區室共定位也證實了自噬的分布[42]。此外，當抗原水平非常高時，自噬對于mTECs和APCs的多肽呈遞似乎是不必要的，APCs可以間接誘導陰性選擇。但在抗原水平較低時，mTECs中自噬依賴性肽的表達變得不可或缺[43]。

為了研究自噬在mTECs陰性選擇中的作用，有研究將Atg5缺陷型小鼠胸腺移植到無胸腺裸鼠體內，導致了由免疫介導的組織炎癥浸潤及自身免疫性疾病的發生。且當從該嵌合體分別轉移純化的CD4+和CD8+T細胞至裸鼠體內時，CD4+T細胞比CD8+T細胞更易于誘發自身免疫性疾病，與Atg5缺陷的胸腺相一致，主要擾亂了CD4+T細胞的選擇[44]。但是這種自身免疫反應的發生是否由于自噬缺失導致的陰性選擇過程中自身反應性T細胞的產生還是由胸腺輸出功能的損傷導致的淋巴細胞減少，還有待研究進一步證實。最近，Aichinger等[45]觀察了自噬存在或缺失時T細胞在陰性選擇中是否能夠識別mTECs表達和呈遞的自身抗原以及免疫逃逸現象的發生。首先，追蹤了識別模型抗原鴿細胞色素c/CYCS(PCC)的T細胞，發現當PCC以其天然形式表達為TECs中線粒體自身抗原時，在特異性CD4+T細胞陰性選擇過程中MHC-Ⅱ直接呈遞過程需要完整的自噬途徑。值得注意的是，當PCC表達為膜蛋白時，該過程卻獨立于自噬。表明抗原的亞細胞分布影響抗原的直接過程是否依賴于自噬。此外，通過對相同的mTECs特異性抗原與“天然”和“突變”LC3融合，研究其是否靶向自噬體降解，結果表明當表達相同水平抗原時，與突變組相比，自噬小體靶向模型抗原且特異性CD4+T細胞的陰性選擇過程效率更高[46]。

4 小結

正常機體的免疫系統能有效地區分“自身”與“異己”成分[47]。免疫系統對自身抗原的無反應性是通過免疫耐受機制而形成。T細胞在胸腺發育期間，每個T淋巴細胞表面都會產生唯一且特異的TCR，由于其隨機性，這個過程不可避免地也會導致潛在的可能會識別“自我”的T淋巴細胞的產生[48]。自身耐受機制的破壞常導致多發性硬化、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發生[49,50]。胸腺在形成中樞免疫耐受以及指導T細胞發育中有著重要的作用[51]。綜上所述，TECs中自噬缺陷所引起的陽性選擇和陰性選擇的干擾可能協同促進自身免疫。首先，cTECs上MHC配體組成的改變可能影響陽選，影響胸腺細胞TCR的形成，可能會促進自身免疫。其次，mTECs損害的TRAs的呈遞可允許本應被克隆刪除或者偏向調節性T細胞譜系的自體反應性胸腺細胞輸出到外周。因此，通過對胸腺上皮細胞內自噬進行干預有可能通過影響T細胞在胸腺內分化發育、成熟的過程，減少使自身反應性T細胞輸出，從而預防自身免疫反應的發生，有可能成為未來治療及預防自身免疫疾病發生發展的新靶點和方向。