橡膠草SRPP2 基因克隆及表達分析

張睿珠 江羽宸 黃俊 閆潔

（石河子大學生命科學學院，石河子 832000）

天然橡膠（Natural rubber，NR）是植物類異戊二烯代謝途徑中一種重要的次生代謝產物，其彈性、延展性、散熱性等性能都優于合成橡膠。因此，NR 作為一種重要的能源物質，在國民經濟和國防建設中有至關重要的作用。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是NR 原料的主要來源，但存在種植地域局限性、真菌易感性及收割工作的繁瑣性等問題。為滿足天然橡膠逐年上升的需求量，各國政府和跨國公司都將尋找NR 替代資源列入戰略計劃中［1］。

在已探明的2500 多種產膠植物中，橡膠草（Taraxacum kok-saghyzRodin） 和 銀 色 橡 膠 菊（Parthenium argentatumL.）產膠的相對分子質量較大，能夠滿足工業應用需求。其中，橡膠草適應性強、生長周期短、適合機械化種植和采收，是理想的天然橡膠替代資源，具有極高的開發價值；又因其基因組相對簡單，遺傳轉化與基因編輯較為容易，可作為科學研究的模式植物。李家洋研究組運用PacBio 單分子實時測序技術（SMRT）組裝完成了高質量的橡膠草基因組草圖，為天然橡膠研究奠定了堅實的基礎［2］。

橡膠粒子是天然橡膠生物合成與貯存的重要場所，根據其直徑的不同可分為小橡膠粒子（Small rubber particles，SRPs）和大橡膠粒子（Large rubber particles，LRPs）。橡膠粒子的膜蛋白，如橡膠轉移酶（Rubber transferase，HRT）、橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）和小橡膠粒子蛋白（SRP protein，SRPP），是橡膠生物合成的關鍵酶或蛋白因子［3-6］。所有的REF 和SRPP 蛋白都有一個REF保守結構域，不同的是大部分SRPPs 家族成員位于SRPs，SRPPs 蛋白家族N 端較短，且有一個可變C 端。橡膠草基因組共編碼五個TkSRPP 蛋白，相關研究表明，TkSRPP3、TkSRPP4和TkSRPP5基因在膠乳中的表達量較高［7］。通過抑制TkSRPP3基因的表達，橡膠草根中的乳膠含量和橡膠相對分子質量均顯著降低［8］。由此可見，SRPP 在維持橡膠粒子穩定和天然橡膠合成等方面都有重要作用。

SRPP基因在橡膠樹乳管細胞中高水平表達，SRPP 是催化和調控橡膠生物合成的重要蛋白因子［9］。為探究SRPP2 蛋白在橡膠草中的作用，本研究通過提取橡膠草RNA，反轉錄得到橡膠草cDNA全長，克隆橡膠草小橡膠粒子蛋白（SRPP2）基因，并命名為TkSRPP2。運用生物信息學的方法對該基因序列進行同源性分析、亞細胞定位預測、蛋白質結構預測，構建細胞融合表達載體，并進行煙草亞細胞定位預測，為深入研究TkSRPP2基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆野生型（Wild Type，WT）橡膠草（Taraxacum kok-saghyzRodin）無菌苗由石河子大學農業生物技術重點實驗室培養。

1.2 方法

1.2.1TkSRPP2的克隆 利用李家洋課題組公布的橡膠草基因組數據，運用Primer Premier 5.0 設計TkSRPP2基因引物，用TkSRPP2-F 和TkSRPP2-R（表1）；以橡膠草cDNA 為模板，克隆橡膠草TkSRPP2基 因。PCR 體 系：10 μL Mix；8 μL ddH2O；1 μL cDNA；0.5 μLTkSRPP2-F；0.5 μLTkSRPP2-R。PCR反應程序：94℃預變性1 min；94℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸60 s，35 個循環。

1.2.2TkSRPP2生物信息學分析 利用NCBI 中的Blast 數據庫，獲得15 條相似度較大的CDS 序列，利用MTGA7.0 對所得序列進行聚類分析并構建系統進化樹。利用Vector NTI Advance 11 獲得TkSRPP2基因的氨基酸序列，使用在線生物軟件ExPASY ProtParam tool、SOPMA secondary structure prediction、SWISS-MODEL 等在線軟件分析其蛋白質理化性質并構建其三維蛋白模型。利用SignalP3.0Server（http：//http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預測信號肽，使用在線軟件WoLF PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）對TkSRPP2 蛋白亞細胞定位進行預測。通過NCBI 中的Blastp 工具對TkSRPP2 蛋白的保守結構域進行分析。利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測分析TkSRPP2 蛋白的跨膜區。

1.2.3 細胞融合表達載體構建 設計引物并命名為Y-TkSRPP2-F 和Y-TkSRPP2-R（表1），克隆去終止子且帶有XhoLI 和BamHI 兩個酶切位點的TkSRPP2基因。PCR 反應條件為94℃預變性1 min；94℃變 性15 s，62℃退 火15 s，72℃延 伸60 s，35 個循環。回收得到的目的片段與細胞融合表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP連接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α 感受態細胞并進行重組子篩選鑒定，獲得細胞融合表達載體pCAMBIA2300-35S-GFPTkSRPP2。

1.2.4 煙草表皮細胞的瞬時轉化 參照于小帆等［10］的植物亞細胞定位方法，采用注射法進行煙草葉片瞬時表達的亞細胞定位。煙草注射菌液后在22-24℃下培養48 h。將處理后煙草葉片使用酶解法制備原生質體，共聚焦顯微鏡觀察TkSRPP2 蛋白質的定位。

1.2.5 橡膠草TkSRPP2基因的時空表達分析 研究基于已公布的橡膠草基因組數據，選取穩定的GAPDH基因為內參基因［11］，用Primer5.0 設計引物，分 別 命 名 為q-TkSRPP2-F、q-TkSRPP2-R（表1）。提取6 月齡橡膠草不同組織及不同生長期橡膠草植株根部RNA 并反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR，檢測6 月齡橡膠草不同組織及不同生長期橡膠草TkSRPP2基因表達量的差異。

表1 實驗所用引物

2 結果

2.1 TkSRPP2基因的克隆與分析

以橡膠草cDNA 為模板，根據橡膠草全基因組數據設計特異引物TkSRPP2-F 和TkSRPP2-R，進行PCR 擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示：在大約633 bp 處有單一的特異條帶，片段大小與理論值相符，將所得片段測序，測序結果與已公開基因序列相符，將其命名為TkSRPP2。

圖1 TkSRPP2 基因的克隆

2.2 TkSRPP2基因的生物信息學分析

2.2.1 TkSRPP2 蛋白結構的預測與分析 通過NCBI中的Blastp 工具對TkSRPP2 氨基酸序列進行分析，結果顯示TkSRPP2 蛋白均具有一個REF 超家族保守結構域。經在線生物軟件ExPASY ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）分析可以得出，TkSRPP2 蛋白共有210 個氨基酸；理論分子量為23.15 kD；理論等電點為8.51，屬于堿性蛋白；不穩定性系數為41.02，屬于不穩定蛋白；平均親水性為-0.180，為親水性蛋白。在線軟件SOPMA 預測TkSRPP2 蛋白質的二級結構，發現其主要由66.19%α 螺旋構成，其次為26.19%無規則卷曲、4.29% β-轉角。利用SWISS-MODEL 軟件構建其三維蛋白模型（圖2）。TkSRPP2 蛋白沒有跨膜區，不屬于跨膜蛋白。SignalP3.0Sever 預測TkSRPP2 蛋白質沒有信號肽，不屬于分泌蛋白。亞細胞定位預測結果表明TkSRPP2 蛋白主要分布于細胞質中。

圖2 TkSRPP2 蛋白的三級結構預測

2.2.2 系統進化樹的構建TkSRPP2基因編碼的氨基酸序列經BLAST 比對，與萵苣（Lactuca sativa）、黃 花 蒿（Artemisia annua）、 向 日 葵（Helianthus annuus）、 洋 薊（Cynara cardunculus var. scolymus）、短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）等的抗脅迫蛋白或小橡膠粒子蛋白具有同源性，相似度均在90%以上。運用MEFA7.0 構建系統進化樹，結果（圖3）表明，TkSRPP2 氨基酸序列與萵苣SRPP3 親緣關系最近。

2.3 細胞融合表達載體

將去終止子的目的基因片段與克隆載體pMD19T 連接， 以此獲得重組質粒pMD19-TTkSRPP2。將測序鑒定正確的 pMD19-T-TkSRPP2重組質粒和細胞融合表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP同時用XbaⅠ和BamH Ⅰ進行雙酶切，連接并轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，挑取抗性篩選平板上的單菌落，做菌落PCR 鑒定；PCR 鑒定為陽性的菌落擴繁提取質粒，并做雙酶切鑒定（圖4），成功構建細胞融合表達載體pCAMBIA2300-35S-GFPTkSRPP2。

圖3 TkSRPP2 系統進化樹分析

圖4 pCAMBIA2300-35S-GFP-TkSRPP2 雙酶切鑒定圖

圖5 TkSRPP2 亞細胞定位圖

2.4 TkSRPP2蛋白亞細胞定位

在模式植物煙草體內進行瞬時表達，用酶解法處理侵染后的葉片，成功制備原生質體后，在激光掃描共焦顯微鏡下觀察，分析橡膠草TkSRPP2 蛋白的亞細胞定位情況（圖5）。顯微鏡下多數細胞中均有熒光，橡膠草TkSRPP2 蛋白定位于植物細胞質內，與其功能及預測結果相符。

2.5 TkSRPP2基因的時空表達特異性分析

采用qRT-PCR 分析橡膠草TkSRPP2基因的時空表達特異性，檢測TkSRPP2基因在6 月齡橡膠草根、葉、花、花葶等不同組織表達情況以及在1 月齡、3 月齡、5 月齡、6 月齡、7 月齡、8 月齡不同生長期橡膠草根部的表達量。結果（圖6）表明，TkSRPP2基因在6 月齡橡膠草根部表達量最高；6月齡橡膠草根部TkSRPP2基因表達量到達峰值。

3 討論

天然橡膠是一類有經濟價值的聚異戊二烯鏈，存在于約2500 種植物的膠乳細胞中。雖然不同物種膠乳中的化學成分存在一定差異，但天然橡膠生物合成的機制相似，植物體內主要通過MVA 的類異戊二烯代謝途徑完成天然橡膠的合成，都涉及酶與膠乳中橡膠粒子結合的過程［12-13］。橡膠粒子中含有300 種以上蛋白質，其中橡膠延伸因子（REF）和小橡膠粒子蛋白（SRPP）含量最高［14］。經系統進化關系研究發現，REF 蛋白和SRPP 蛋白為同源蛋白，都屬于植物應激相關蛋白超家族［4］，在橡膠樹乳管細胞中，REF和SRPP家族基因均有很高的表達量［9］。在銀膠菊、橡膠草等產膠植物的乳膠中均發現了SRPP 蛋白，短角蒲公英的SRPP 蛋白與橡膠草中的極為相似，與橡膠粒子密切相關［15-16］。由此可見，這些基因與橡膠的生物合成相關。SRPP 蛋白屬于植物抗逆蛋白家族中的一員，已有研究表明，在環割脅迫后，SRPP 蛋白出現高表達和大量累積［17］；研究者在巴西橡膠樹SRPP基因啟動子的研究中發現，SRPP基因啟動子存在熱響應元件、脫落酸響應元件等順式作用元件，據此推測SRPP基因在抵御逆境脅迫的生理過程中可能具有重要的功能［18］。

本研究從橡膠草植株中克隆得到全長633 bp 的編碼序列，并將其命名為TkSRPP2。實時熒光定量分析結果顯示，該基因主要在橡膠草根中表達，與其協助橡膠草產膠的功能一致；6 月齡橡膠草根部TkSRPP2基因表達量達到峰值，此時橡膠草乳管分化最為完全。由此可見，TkSRPP2基因功能與乳管分化息息相關。運用NCBI 中的Blastp 功能進行結構域預測，發現TkSRPP2 蛋白有一個REF 保守結構域，符合SRPP 家族的基本特征。通過相關軟件預測TkSRPP2 蛋白結構及性質，結果表明，該蛋白屬于堿性、親水性、不穩定蛋白，沒有信號肽及跨膜結構域。亞細胞定位預測結果表明TkSRPP2 蛋白主要位于細胞質中，這一預測結果與煙草亞細胞定位結果相符。已有研究表明，SRPP 蛋白可能會通過滲透作用從橡膠粒子中釋放，在橡膠粒子膜脂質的頭部基團起到類似于“覆蓋”的作用［19］，本研究的預測結果符合這一特征。在橡膠樹中，SRPP 蛋白被認為存在于橡膠粒子膜上，起到維持膠體穩定性的作用，在調控膠乳形成過程中起著重要作用［20］。進化樹分析結果表明，產膠植物的REF/SRPP 家族成員分布于一大支，其中橡膠草TkSRPP2 蛋白與萵苣SRPP3 蛋白有最近的親緣關系，橡膠樹SRPP 家族成員分布于另一小支，這也表明橡膠草TkSRPP2 蛋白與橡膠樹SRPP 蛋白具有相似功能。這些研究為TkSRPP2基因功能的探索提供了重要依據。

圖6 TkSRPP2 基因時空表達分析

4 結論

以橡膠草cDNA 為模板，克隆得到TkSRPP2基因。該基因主要在根部表達，在6 月齡橡膠草根部表達量達到峰值，TkSRPP2 蛋白定位于細胞質中。