粳型恢復系C418轉基因再生體系的建立

張曉磊， 韋永貴， 董卓婭， 孫宏偉， 羅 龍

(文山州農業科學院， 云南 文山 663099)

水稻(OryzasativaL.)原產于中國，是全球最重要的糧食作物之一。高產優質及強抗逆性是水稻育種的主要目標，隨著科學技術的進步，利用基因工程技術選育高產抗逆新品種成為保證和提高水稻產量的重要技術之一。水稻基因轉化能否成功的關鍵在于選擇和建立良好的植物受體系統。20世紀90年代初，HIEI 等[1]首次利用農桿菌介導法實現對粳稻的高效轉化，農桿菌介導法進入水稻遺傳轉化的實用階段。由于農桿菌轉化取決于外植體培養所得的愈傷組織質量，愈傷組織的誘導狀態直接決定水稻遺傳轉化的效率。因此，在水稻育種中，愈傷組織誘導是建立水稻轉基因再生體系中最基礎的環節。郭麗[2]以水稻成熟種子為材料研究不同培養基、不同濃度激素及不同激素配比多種因素對水稻愈傷組織的形成及生長狀態的影響，結果顯示，常規培養基(N6、B5)無法滿足水稻生長所需的營養，組合培養基(NB、MS)誘導的愈傷組織出愈率高，生長狀態好。韋新宇等[3]研究表明，水稻基因型及培養基中添加的激素含量、激素類別及配比均影響水稻愈傷組織誘導。唐軒等[4]采用農桿菌介導法將外源基因導入粳稻中，成功獲得轉基因體系。目前，在水稻愈傷組織誘導的研究方面，組合培養基與常規培養基的對比試驗僅有小范圍分析，不利于水稻愈傷組織培養條件優化。鑒于此，筆者等擬通過擴大范圍比較不同培養基對水稻愈傷組織誘導的影響，優化水稻愈傷組織的培養，為后續水稻再生體系的建立提供有利條件。研究通過植物組織培養技術和農桿菌介導法建立水稻轉基因再生體系，分析不同2,4-D濃度和不同誘導培養基對水稻成熟胚誘導的影響，建立粳型恢復系C418轉基因再生體系，以期為水稻轉基因育種和突變體庫的建立創造有利條件。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1水稻材料北方骨干粳型恢復系C418，早熟中粳類型，四川農業大學作物遺傳育種重點實驗室提供， 于-20℃冰箱保存。

1.1.2試劑及菌株2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)植物生長調節劑，4℃避光存放。含目的質粒的農桿菌菌株pCAMBIA1301，-80℃冰箱保存，四川農業大學作物遺傳育種重點實驗室保存并提供。

1.1.3培養基7種基礎培養基(N6、MS、MSN、NMB、NB、MB和NBD)，繼代培養基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，懸浮培養基(AA大量+MS微量+AA有機+鐵鹽+L-Pro+CH+suger，pH 5.2)，共培養基(N6大量+N6微量+N6有機+鐵鹽+CH+suger+葡萄糖+phy+2,4-D，pH 5.2)，篩選培養基(N6大量+B5微量+B5有機+鐵鹽+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+Cef+Amp+潮霉素，pH 5.2)，預分化培養基(N6大量+B5微量+B5有機+鐵鹽+ L-Pro+CH+suger+phy+2,4-D+6-BA+NAA+ABA+潮霉素，pH5.2)，分化培養基(N6大量+B5微量+B5有機+鐵鹽+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+6-BA+NAA+IAA+KT+潮霉素，pH 5.2)，YM培養基(微生物培養基，0.15 g/L KH2PO4+10 g/L甘露醇+Glu+NaCl+MgSO4+Yeast extract)，LB液體培養基(含75mg/L Kan+50mg/L Rif)。所有培養基均在HVE-50高壓滅菌鍋113℃滅菌20 min。

1.2試驗方法

1.2.1外植體滅菌處理將粳型恢復系C418水稻籽粒用礱谷機去除外殼，選取具完整胚的籽粒作為外植體，放入已滅菌的250 mL錐形瓶中，在超凈工作臺進行外植體滅菌。先用75%酒精消毒1 min，無菌去離子水沖洗1遍；再分別用1.5%和2.5%次氯酸鈉處理20 min，期間3～5 min搖動1次或封口放恒溫振蕩培養箱(100 r/min)。外植體用無菌去離子水沖洗5～7遍，封口前和解封后將錐形瓶瓶口在酒精燈外焰下滅菌，確保外植體滅菌過程無污染。最后將處理好的水稻成熟胚(外植體)置于已滅菌帶濾紙的培養皿，干燥后進行后續接種。

1.2.2成熟胚愈傷組織的誘導接種前用75%的乙醇溶液對臺面及所需器具消毒，將消毒好的器具在酒精燈外焰下烘干。用鑷子挑取已滅菌外植體接種于不同培養基(7種基礎培養基)分別添加不同濃度2,4-D(1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)的誘導培養基，每皿接種水稻成熟胚為25～30粒，5次重復。接種結束封口，置于相對濕度60%、溫度(28±1)℃的恒溫恒濕培養箱暗培養10～14 d。記錄出愈數及愈傷生長狀況，計算愈傷誘導率。

1.2.3水稻愈傷組織的繼代將愈傷組織用已滅菌的鑷子挑出接種于繼代培養基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，置于相對濕度60%、溫度(28±1)℃的恒溫恒濕培養箱中暗培養10 d。

1.2.4水稻愈傷組織的轉化

1) 農桿菌懸浮液的制備。參照吳仙花[5]的方法，將農桿菌菌株pCAMBIA130劃線于農桿菌培養基(YM培養基+LB培養基)平板上，28℃培育2 d。選擇適度大小的白色單菌落，用已滅菌的槍頭挑菌，接種于10 mL YM液體培養基中，在28℃、250 r/min振蕩培育至OD600值0.5。然后吸取培養液1 mL接種于100 mL LB液體培養基中，于28℃、250 r/min振蕩培養至OD600最佳值0.8(OD600值不可超過1.0)。搖菌后，準備2個已滅菌的50 mL離心管，倒入30 mL LB液體培養基，室溫下4 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，加1 mL LB液體培養基于離心管中，用空槍吹懸浮沉淀的菌體，沖洗細菌。移入50 mL離心管中，再加30 mL LB液體培養基，室溫下4 000 r/min離心15 min，去掉上清液。最后加入終濃度為100 μM的As(乙酰丁香酮)，用LB液體培養基稀釋菌體直至OD600值為0.4左右，獲得農桿菌懸浮液。

2) 水稻愈傷組織的共培養。將經繼代培養的愈傷組織(直徑保持0.5 cm左右)放入農桿菌懸浮液中，搖床搖30 min，倒掉液體。將愈傷組織置于已滅菌帶濾紙的培養皿，干燥后接種于共培養基，暗培育2～3 d。

3) 抗性愈傷組織篩選。將共培養后的水稻愈傷組織收集于已滅菌的250 mL錐形瓶，用無菌水洗8～10遍。瓶中留100 mL無菌水，加入2 mL 500 mg/L頭孢霉素，100 r/min振蕩30 min。倒掉無菌水，將愈傷組織置于已滅菌帶濾紙培的培養皿，無菌工作臺靜置1～2 h，待愈傷組織表面水分完全蒸發后接種于含50 mg/L氨芐霉素與50 mg/L潮霉素的篩選培養基上，(28±1)℃暗培養3周。

4) 愈傷組織的分化、生根及移植。將所得的抗性愈傷組織接種于預分化培養基上，置于相對濕度60%、溫度(25±1)℃的恒溫恒濕培養箱中暗培養3周，接種于分化培養基上(光照16 h/d，光強為2 000 lx)，待再生苗長至5 cm左右轉移到生根培養基。當再生苗根系強健時將其移栽到含有N、P、K營養成分的盆中，置于溫室培養至植株成熟。

1.2.5相關指標計算愈傷誘導率=(長愈傷的成熟胚數/接種成熟胚數)×100%，愈傷分化率=(出小苗的愈傷組織數/接種愈傷組織數)×100%，外植體污染率=(被污染成熟胚數/接種成熟胚數)×100%。

1.2.6 數據統計分析使用SPSS20.0軟件進行數據統計分析。

2結果與分析

2.1次氯酸鈉濃度對外植體污染率的影響

不同濃度次氯酸鈉對水稻成熟胚外植體的滅菌效果存在差異。2.5%次氯酸鈉處理的外植體，其污染率為11.55%，而1.5%次氯酸鈉處理外植體的污染率為24.68%。說明，高濃度次氯酸鈉對外植體的滅菌效果優于低濃度。

2.2培養基與2,4-D濃度對水稻愈傷誘導的影響

2.2.1培養基單因素影響NBD、MSN和N6愈傷誘導效果較好，誘導率分別為81.07%、72.70%和69.67%，三者間差異不顯著；NMB、MS愈傷誘導效果一般，誘導率分別為66.87%和66.40%，顯著低于NBD、MSN和N6；NB 和MB愈傷誘導效果最差，誘導率分別為58.40%和50.13%，顯著低于其余培養基。

2.2.22,4-D濃度單因素影響2,4-D濃度為2 mg/L和3 mg/L的愈傷誘導率分別為76.73%和69.06%，二者間誘導率差異不顯著；2,4-D濃為度1 mg/L的愈傷誘導效果效果較差，誘導率為53.69%，顯著低于濃度為2 mg/L和3 mg/L的處理。

2.2.3培養基與2,4-D濃度互作影響方差分析表明，不同培養基+不同濃度2,4-D對外植體愈傷誘導效果不同，兩者的互作效應達顯著水平。NBD培養基+3 mg/L 2,4-D處理的愈傷組織誘導率最高，達90.38%，且愈傷組織生長狀態最佳。

2.3農桿菌介導的水稻愈傷組織轉化效果

繼代培養所得的優良愈傷組織經農桿菌介導進行遺傳轉化表明，共培養2 d時獲得的抗性愈傷組織最多(圖1)，愈傷組織轉化率達80.76%；共培養3 d時，多數愈傷組織在篩選培養基上生長緩慢，逐漸褐化死亡，僅少數愈傷組織可以獲得抗性愈傷組織，愈傷組織轉化率為42.31%。

注：a愈傷組織在共培養基；b、c為抗性愈傷在篩選培養基(b為共培養2 d；c為共培養3 d)

Note: a, calli cultured on co-medium; b and c, resistant calli on screening medium for 2 d and 3 d respectively

圖 1水稻愈傷組織的轉化

Fig.1 Transformation of rice calli

2.4抗性愈傷分化效果

在篩選培養基中使用1 000 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L潮霉素時，抑制農桿菌的生長，愈傷組織分化率為53.78%，而500 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L氨芐霉素+50.0 mg/L潮霉素愈傷組織分化率為71.25%。即較高濃度頭孢霉素抑制水稻愈傷組織的分化，通過降低頭孢霉素濃度并添加適宜濃度氨芐霉素，可明顯提高愈傷組織分化率。

3結論與討論

3.1誘導培養基及其生長素2,4-D濃度的選擇

研究表明，在相同培養環境下，NBD誘導培養基的水稻成熟胚愈傷組織誘導率最高，達90.38%；MSN和NMB愈傷組織誘導率較好，誘導率分別為88.01%和84.98%；N6和MS培養基的愈傷誘導效果一般，誘導率分別為72.88%和64.42%；NB 和MB愈傷誘導效果最差，誘導率分別為43.91%和38.80%。劉國寶等[6]采用NMB和MS培養基誘導水稻成熟胚表明，NMB培養基愈傷組織誘導率高于MS培養基，且愈傷組織質量優于MS培養基，與該研究結論不一致，可能與不同水稻品種的外植體有關。在不同濃度激素條件下，2 mg/L 2,4-D濃度水稻成熟胚愈傷組織誘導率最高，為76.73%，3 mg/L 2,4-D和1 mg/L 2,4-D的誘導率分別為69.06%和53.69%。不同培養基和不同濃度激素配比對水稻成熟胚愈傷組織的誘導均存在影響[3]，培養基與2,4-D濃度存在顯著的互作效應，其中以NBD培養基添加3 mg/L 2,4-D處理的粳稻C418成熟胚愈傷組織誘導率最高，達90.38%，且愈傷組織生長狀態最佳。

3.2水稻愈傷組織轉化和分化條件的優化

KAWATA等[7-8]研究顯示，水稻成熟胚外植體愈傷組織共培養2 d時獲得的抗性愈傷組織最多，之后隨共培養時間延長多數愈傷組織生長緩慢，并逐漸褐化死亡。粳稻C418成熟胚外植體愈傷組織共培養2 d時獲得的抗性愈傷組織最多，共培養3 d時接種于篩選培養基中的多數愈傷組織生長緩慢，并逐漸褐化死亡，僅少數愈傷組織可以得到抗性愈傷，與前人的研究結果一致。NISHI等[9]研究發現，在接種篩選培養基之前，干燥處理可抑制農桿菌生長和繁殖，提高抗性愈傷組織的獲得率；同時，抗生素添加類別對水稻愈傷組織的分化具有較大影響。在篩選培養基中使用1 000 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L潮霉素時，抑制農桿菌的生長，粳型恢復系C418成熟胚愈傷組織的分化率明顯低于500 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L氨芐霉素+50.0 mg/L潮霉素處理，說明，較高濃度頭孢霉素抑制水稻愈傷組織的分化。通過降低頭孢霉素濃度并添加適宜濃度氨芐霉素，可明顯提高愈傷組織分化率，結論與前人研究基本一致。

3.3建立粳型恢復系C418轉基因再生體系

通過培養基類型、激素濃度、共培養時間及抗生素種類的最佳組合，成功建立北方骨干粳型恢復系C418轉基因再生體系,即水稻外植體經次氯酸鈉處理后接種于誘導培養基NBD+3 mg/L 2,4-D，獲得愈傷組織，再用農桿菌懸浮液(含目的基因)侵染愈傷組織，初步獲得轉基因植株。