基質水活度對冠突散囊菌生物轉化茶葉成分的影響

劉斌杰， 嚴蒸蒸， 譚 詠， 吳志超， 黃鷺強， 楊民和

(福建師范大學 生命科學學院， 福建福州 350107)

“發花”是茯磚茶加工過程中特有的工序，其實質是以冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)為主的多種散囊菌屬真菌以茶葉為基質的固態發酵過程。發花過程中，真菌在茶葉中旺盛生長，呈現黃色或金黃色菌絲體，俗稱“金花菌”[1-2]。包裝后的茶葉產品儲放于干燥的庫房中陳化至少半年以上，促進“金花菌”的大量發生，并以“金花菌”的數量和旺盛程度作為茯磚茶發酵成功與否和質量好壞的標準[3]。適合的發花條件下，真菌利用茶葉作為有機質充分生長，產生和分泌水解酶轉化茶葉成分，產生豐富的轉化產物，與菌體成分混合共同形成茯磚茶特有的品質和風味，表現有益的生理功能[3-5]。

水活度(Water activity, aw)是指在一定的溫度和壓力下基質(Substrate)蒸汽壓和純水蒸汽壓的比值，用于衡量培養基質中可以被微生物利用的水分含量或自由水[6-7]。水活度這一概念在食品和飼料行業中使用較為常見，在一些纖維質材料如書籍、文物和標本的保藏方面也有著廣泛的應用[8]。在實驗室研究中，常用甘油、NaCl和蔗糖作為溶質來調節培養基的水活度[ 6, 8-9]，以考察微生物對不同水活度(或干燥程度)的反應。一般來說，溶質的濃度越高，滲透壓越大，配制成的培養基水活度越低，可利用水分越少。

大量的研究表明，基質水活度或環境干燥程度是影響微生物生長、代謝和繁殖的重要生態因素[10]。如基質水活度能明顯影響真菌的生長[6-7, 10]、基因表達[11]、蛋白(或水解酶)分泌[5, 11]和毒素產生[9]，因而影響真菌對環境中有機質和能量的利用，決定其生態競爭能力。散囊菌屬的真菌大都是嗜高滲透壓的微生物，在低水活度的基質中才能正常生長[5, 10]。環境條件如溫度、滲透壓和水活度是限制冠突散囊菌菌絲生長、分生孢子發芽和無性孢子、有性孢子分化的重要因素[1, 10-11]，但冠突散囊菌如何適應茶葉這類特殊基質和茶葉加工過程中的高溫而發展成優勢真菌，目前還不清楚。為了解基質水活度對冠突散囊菌生長和茶葉成分轉化作用的影響，筆者等以甘油調節培養基的水活度，以綠茶粉為主要成分設計簡化的培養條件，研究不同水活度條件下冠突散囊菌菌株(FZ-2)對茶葉主要成分代謝的影響；并采用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)分析相結合，分析水活度對真菌發酵后茶葉香氣成分的影響，以期為茯磚茶加工生產和質量提升提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌株：冠突散囊菌(FZ-2)，分離自茯磚茶(湖南益陽茶廠，2008年5月9日生產)。供試菌株生長于DG18培養基[8]斜面上，于4℃冰箱保存在福建師范大學生命科學學院微生物實驗室。

儀器：PawKit便攜式水活度儀(美國Decagon公司)，恒溫培養箱(上海一恒公司)，高壓滅菌鍋(日本HIRAYAMA有限公司)，STARTER2100 pH計(美國奧豪斯有限公司)，微萃取裝置(50/30 μmDVB/CAR/PDMS，美國supelco公司)。

試劑：蛋白胨、無水葡萄糖、KH2PO4、無水MgSO4，西隴科學有限公司；瓊脂(金燕海洋生物有限公司)，甘油(飛揚化工有限公司)，綠茶粉(安徽省亳州市淳興堂藥業有限公司，2017年6月10日生產)。

1.2方法

1.2.1培養基的配制

1) 改良DG18培養基。在DG18培養基的基礎上去除氯硝胺。培養基配方為：蛋白胨5.0 g/L，無水葡萄糖10.0 g/L，KH2PO41.0 g/L, 無水MgSO40.5 g/L，瓊脂20 g/L，甘油180.0 g/L。

2) 液體發酵培養基。在改良DG18培養基的基礎上去除瓊脂和葡萄糖，甘油作為唯一的碳源，添加不同比例的甘油(不添加甘油的培養基以添加葡萄糖為碳源)。采用PawKit便攜式水活度儀檢測水分活度(aw)，調節培養基的aw分別為0.99、0.95和0.83。配制完成后，每個三角瓶分裝量為100 mL，配制好的培養基于115℃高壓滅菌30 min。

3) 綠茶粉-甘油培養液。稱取5 g綠茶粉用1 000 mL沸水溶解，經過濾后，添加不同濃度的甘油，調節培養基的水活度分別為0.99、0.95和0.83，配制完成后，每個三角瓶分裝量為100 mL，滅菌。

1.2.2試驗設計菌株FZ-2培養于DG18培養基，于28℃恒溫培養5～7 d后收集分生孢子。配制濃度為5.0×107～6.0×107個孢子/mL的孢子懸浮液。將菌株FZ-2的孢子懸浮液分別以1%的比例接種于不同水活度的綠茶粉-甘油培養液中進行發酵，每處理設置3個重復，置于搖床28℃、200 r/min下培養10 d后過濾去除菌絲體，取發酵液測定總可溶性糖、氨基酸和茶多酚的含量。

1.2.3生物量的測定取液體發酵培養基中培養5 d后的培養液用布氏漏斗過濾，收集菌體，并用預冷的蒸餾水沖洗菌體3遍，洗去附著于菌體上的甘油。在烘箱內充分干燥菌體至恒重，測量其干重即為菌體生物量，每個樣品測3次取平均值。

1.2.4理化指標的測定pH采用STARTER2100 pH計分別測定液體發酵培養前和培養5 d后不同樣品的pH，每個樣品測3次，取平均值。可溶性糖含量采用蒽酮比色法進行檢測[12]。游離氨基酸總量參照GB/T 8314—2013中的方法進行檢測[13]。茶多酚含量參照GB/T 21733—2008中的方法進行檢測[14]。

1.2.5香氣成分的測定對水活度為0.99未經發酵的綠茶粉-甘油培養液和水活度分別為0.99、095和0.83的綠茶粉-甘油培養液進行香氣成分的測定。

1) 頂空固相微萃取。參照王麗麗等[15]的方法，采用微萃取裝置(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)進行萃取。萃取頭的老化溫度為230℃，老化時間為50 min。萃取條件：萃取溫度為80℃，萃取時間為50 min，解析3 min。取2 mL樣品于20 mL頂空瓶中，加入2 g氯化鈉，然后加入10 mL沸水使其充分溶解，再于80℃下用提前預熱后的磁力攪拌器攪拌15 min后，將老化處理后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶，萃取50 min，隨后取出萃取頭，插入氣相色譜儀的進樣口，進行GC-MS檢測。

2) GC-MS檢測。色譜條件：色譜柱為HP-Innowax(60.0 mx0.25 mmx0.25 μm)。升溫程序：50℃保持5 min，以5℃/min升溫至150℃，保持10 min；再以5℃/min升溫至230℃，保持10 min；載氣(He)流速為1 mL/min；進樣量1 μL，不分流。

質譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，母離子m/z 285，激活電壓1.5 V，采集模式為全掃描。

香氣物質成分的定性采用NEST譜庫進行檢索比對，通過化學工作站CAS號查詢得到相關化合物信息，選擇相似指數大于70的化合物定性為一種香氣物質。采用峰面積歸一化進行定量分析，某一組分的峰面積除以總峰面積得到各個香氣物質的相對含量。

1.3數據分析

采用SPSS22.0進行單因素方差(ANOVA)分析來比較不同處理間的差異顯著性，Duncan進行多重比較(P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著)。采用origin 8.0進行圖像處理。

2結果與分析

2.1基質水活度對冠突散囊菌生物量的影響

在水活度分別為0.99、0.95和0.83的液體培養條件下，冠突散囊菌生長良好。培養完成后測得各處理的干重分別為0.135 g、0.258 g和0.121 g(圖1)。水活度為0.99和0.85時，菌株生物量差異不顯著，而與水活度為0.95時的生物量差異極顯著。

2.2基質水活度對pH的影響

從圖2看出，3個不同水活度條件下，冠突散囊菌懸液接種后的初始(0 d)pH分別為5.42、5.48和5.46，差異不顯著。搖瓶培養5 d后，水活度0.99、0.95和0.83條件下的pH分別為5.20、4.61和5.01。水活度為0.99和0.83時，發酵前后pH差異不顯著，而水活度為0.95時發酵前后的pH差異極顯著。

注：不同大寫字母表示不同處理間差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: Different capital letters indicate significance of difference between different treatments atP<0.01 level. The same below.

圖 1不同水活度條件下冠突散囊菌的生物量

Fig.1 Biomass ofE.cristatumunder different water activity

圖2不同水活度條件下發酵培養基的pH

Fig.2 pH value of fermentation medium under different water activity

2.3基質水活度對發酵液可溶性糖含量的影響

從圖3可知，不同水活度條件下菌株發酵10 d后，水活度為0.95和0.83的培養液中可溶性糖含量分別為30.224 μg/mL和32.751 μg/mL，二者之間差異不顯著。水活度為0.99的培養液中，菌株發酵10 d后可溶性糖含量較低。隨著水活度的下降，發酵液中可溶性糖的含量上升明顯。

2.4基質水活度對發酵液中游離氨基酸含量的影響

經冠突散囊菌發酵后，在水活度為0.95和0.83的條件下，氨基酸含量分別為0.075 mg/mL和0.070 mg/mL，兩者之間差異不顯著(圖4)。水活度為0.99的培養液中，發酵后游離氨基酸含量較低，為0.057 mg/mL。

圖3不同水活度條件下冠突散囊菌發酵后的可溶性糖含量

Fig.3 Soluble sugar content of fermentedE.cristatumunder different water activity

圖4不同水活度條件下冠突散囊菌發酵后的游離氨基酸含量

Fig.4 Free amino acid content of fermentedE.cristatumunder different water activity

2.5基質水活度對發酵液中茶多酚含量的影響

從圖5看出，經冠突散囊菌發酵10 d后，培養基水活度為0.99時，茶多酚含量為15.95 mg/100mL。隨著培養基水活度的進一步下降，菌株發酵后培養液中茶多酚含量呈上升趨勢。不同水活度發酵液中的茶多酚含量差異極顯著。當培養基水活度下降至0.83時，茶多酚含量最高，為46.87 mg/100mL。

圖5不同水活度條件下冠突散囊菌發酵后的茶多酚含量

Fig.5 Tea polyphenol content of fermentedE.cristatumunder different water activity

2.6基質水活度對香氣成分的影響

根據質譜數據、相對保留時間，水活度為0.99未發酵和水活度0.99～0.83發酵10 d的香氣成分中共鑒定到56個化合物(表1)。其中，醇類物質14種，酮類物質14種，脂類2種，醛類11種，其他類型化合物共15種。將冠突散囊菌接種于不同水活度的培養基中進行搖瓶發酵10 d后，在水活度為0.99條件下，共檢測到23個化合物，其中醇類物質8種，酮類物質6種，脂類物質1種，醛類物質1種。在水活度為0.95條件下，共檢測到17個化合物，其中，醇類物質6種，酮類物質5種，醛類物質1種，沒有檢測到脂類物質。在水活度為0.83條件下，共檢測到15個化合物，其中，醇類化合物3種，酮類化合物4種，脂類化合物1種，醛類化合物1種。總體上，隨著培養基水活度的下降，檢出的化合物總數和各類物質相對含量均呈下降趨勢。

在水活度為0.99時，與未發酵的相比，真菌發酵導致酮類和醛類化合物數量的明顯下降，醇類物質數量上升。特別是蘑菇醇(1-辛烯-3-醇)、芳樟醇、三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇相對含量明顯上升；蘑菇醇相對含量由5.627%上升到34.331 7%，含量增加6.1倍。同時，真菌發酵產生了芳樟醇、香茅醇、2-庚醇和二氫-β-紫羅蘭醇等醇類化合物。真菌發酵也導致吲哚、苯乙腈、2,4-二叔丁基苯酚和間苯二酚等酚類化合物的降解。

真菌發酵條件下，隨著培養基水活度的下降，茶葉香氣成分中醇類物質和酮類物質的種類和數量均下降。特別是醇類物質如蘑菇醇、芳樟醇、2-乙基己醇、2-庚醇和2-庚醇，在低水活度條件下均明顯下降以致未檢測到。低水活度條件下新檢測到(±)-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、對異丙基苯甲醇、橙花醇和一些酮類化合物，如乙酰丙酮、茉莉酮、二氫-α-紫羅蘭酮和DL-3-甲基環戊酮。低水活度促進咖啡因的降解，有利于苯乙烯、2, 4-二叔丁基苯酚、乙基苯和萘的產生。

表1不同水活度條件下冠突散囊菌發酵后的主要香氣成分及相對含量

續表1

產物類別Product產物名稱Product name分子式Molecularformulaaw 0.99未發酵Un-fermentation匹配度相對含量aw 0.99匹配度相對含量aw 0.95匹配度相對含量aw 0.83匹配度相對含量3-甲基-3-丁烯-1-醇C5H10O----820.748 6--芳樟醇C10H18O--964.898 7953.323 8--香茅醇C10H20O--680.080 7980.342 3--2-庚醇C7H16O--720.356 1----順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫C10H18O2------780.180 7化呋喃-2-甲醇二氫-β-紫羅蘭醇C13H24O--740.067 6----酮類 甲基庚烯酮C8H14O745.114 0781.584 6---- Ketones6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮C8H12O943.117 1------4-[2,2,6-三甲基-7-氧雜二環C13H20O2801.619 9800.307 7720.365 4 740.282 1[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮Z-四氫-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮C10H16O2950.457 9------茉莉酮C11H16O970.259 5700.064 7950.112 2--2,6,6-三甲基-2-環己烯-1,4-二酮C9H12O2910.242 1970.190 8----5,6,7,7A-四氫-3,6-二甲基-C10H14O2600.229 0------2(4H)-苯呋喃酮α-紫羅酮C13H20O970.202 8960.058 3----異佛爾酮C9H14O720.196 1------4-叔丁基苯丙酮C13H18O840.122 4------香葉基丙酮C13H22O910.121 6940.118 7720.046 6860.051 1反-3-氧代-2-(順-2-戊烯基)-C13H20O3950.114 4------環戊乙酸甲酯乙酰丙酮C5H8O2----807.993 1803.016 1DL-3-甲基環戊酮C6H10O------730.069 7二氫-α-紫羅蘭酮C13H22O----820.230 6--酯類 鄰苯二甲酸二異丁酯C16H22O4830.073 7----830.085 8 Esters二氫獼猴桃內酯C11H16O2--730.664 5----醛類 苯甲醛C7H6O895.159 4760.149 1---- Aldehydes苯乙醛C8H8O911.870 7------(E,E)-2,4-庚二烯醛C7H10O911.051 3------己醛C6H12O731.021 7------正辛醛C8H16O800.508 8------反式-2-癸烯醛C10H18O810.432 8------反-2-十二烯醛C12H22O780.362 9------反-2,6-壬二醛C9H14O720.311 6------2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛C10H14O940.234 1------2,6,6-三甲基-1-環己烯-1-羧醛C10H16O980.174 9------癸醛C10H20O--860.170 7----(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛C10H16O----800.311 6870.164 9碳氫化合物 間二甲苯C8H10940.492 1841.153 4951.661 4950.800 9 Hydrocarbon月桂烯C10H16--700.275----萘C10H8----700.215 7600.220 7乙基苯C8H10----780.247 3700.301 4苯乙烯C8H8------942.409 1雜環化合物 吲哚C8H7N972.022 6------ Heterocyclic 苯乙腈C8H7N971.828 2970.419 3---- compound2,4-二叔丁基苯酚C14H22O971.153 5900.132 3960.157 2970.524 1戊四唑C6H10N4780.464 1------苯并噻唑C7H5NS840.153 9------2,6-二叔丁基苯醌C14H20O2930.152 8------咖啡因C8H10N4O2950.096 0950.118 1----2,3-二氫苯并呋喃C8H8O--880.099 4----其他物質 3,7-二甲基-6-辛烯酸C10H18O2----950.065 7-- Other substance

注：—未檢測到的物質。

Note: —means the undetected substance.

3結論與討論

在綠茶粉-甘油培養基的液態發酵條件下，培養基的營養成分主要是綠茶粉(aw0.99)，或是綠茶粉和甘油(aw0.95和aw0.83)。培養基的碳素營養主要來自于茶粉中所含有的纖維素、多糖、茶多酚和添加的甘油，而氮源營養主要來自于茶粉中的茶多酚、氨基酸和生物堿等。冠突散囊菌(FZ-2)可以在甘油為唯一碳源營養的培養中正常生長[10]。在只添加綠茶粉的液體培養基中，冠突散囊菌同樣可以良好地生長。

培養基水活度顯著地影響冠突散囊菌的生長，培養基水活度為0.95時，其菌絲體生長最佳，生物量最大，為0.258 g。散囊菌屬的真菌均是嗜干燥和嗜高滲透壓的微生物，能夠抵抗干燥的空氣和適應各種低水活度的生長環境。冠突散囊菌的不同菌株在水活度為0.77的培養基中能正常生長，在水活度為0.95時生長速度最快[10]，與本研究的試驗結果一致。在茯磚茶加工的“渥堆”階段，環境中大量的微生物參與其中；但后期的“發花”過程中，只有以冠突散囊菌為主的散囊菌菌株形成優勢菌[1, 3]。這可能與“發花”階段茶胚逐漸干燥，茶葉中游離水份減少，比較適合于散囊菌的生長有關。此外，不同水活度條件下，真菌發酵后對茶湯的pH沒有明顯的影響。李適等[16]發現冠突散囊菌發酵后有機酸含量略有下降，但不會造成茶湯滋味的酸化。

總體上，隨著基質水活度的降低(aw0.95～0.83)，干燥程度的上升，有利于冠突散囊菌發酵后茶湯中可溶性糖、氨基酸和茶多酚含量的維持和提升。特別是可溶性糖含量，在低水活度情況下提升顯著。茶多酚、氨基酸、茶多糖和咖啡堿等化合物是茶葉主要的品質成分，在泡茶過程中，這些物質的混合決定茶湯滋味。在以綠茶粉為培養基主要成分時，菌株冠突散囊菌利用這些物質作為碳、氮營養而生長，導致茶多酚和生物堿的含量下降，從而降低茶湯的苦澀味，使茶湯滋味變得甘厚醇和。茶葉在微生物發酵后，茶多酚、氨基酸、茶多糖等主要滋味成分含量下降，已經得到大量的試驗數據支持[4, 17-19]。黑茶陳化時間的延長和茶葉的持續干燥，可能更加不利于腐敗微生物的生長，但對散囊菌影響不大[10]，這一狀態對維持黑茶的主要品質成分可能是有益的。本試驗檢測的僅僅是可溶性糖、氨基酸和茶多酚的含量，各類化合物在菌株發酵后的具體組分和數量變化，需要采用其他的分析手段作更為精細的分析。

在水活度為0.99時，與未發酵相比，冠突散囊菌發酵后茶葉醇類香氣成分如蘑菇醇、芳樟醇、香茅醇、三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇和二氫-β-紫羅蘭醇相對含量上升。這一結果與沈程文等[20-22]在不同試驗條件下的研究結論一致，表明冠突散囊菌發酵導致茶葉香氣物質的成分和含量變化是一種普遍的現象。茯磚茶香氣成分的研究大多選擇固態發酵條件和成品茶，已檢測到的主要香氣物質包括芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、α-紫羅酮、β-紫羅酮、橙花叔醇、香葉基丙酮、香葉醇和甲氧基類化合物等[2, 20-21, 23]；但大多數沒有檢測到蘑菇醇，或蘑菇醇雖是香氣的基本成分但不是主要成分[24-25]。蘑菇醇是真菌(包括一些美味的食用菌)的主要揮發性香氣成分[26]，近年來發現其有重要的生理功能[27]。在試驗設置的液體發酵條件下，蘑菇醇成為主要的香氣物質，這可能與發酵原料、發酵條件和香氣提取方法有關。與當前普遍采用的茶葉固態發酵(如渥堆、發花)相比，茶湯的液態發酵可以在大型發酵罐中的控制條件下進行，液體發酵的優勢可以為茶飲料的發展創造條件。香氣是茶葉和茶飲料的重要品質成分[4, 24]，微生物發酵后蘑菇醇、芳樟醇、2-庚醇和香茅醇等香氣物質的產生或增加，對提升茶飲料的品質和市場價值是有益的。

隨著基質水活度的下降，冠突散囊菌發酵后，茶葉香氣化合物總數和各類物質相對含量均呈下降趨勢；同時在不同水活度條件下，也產生了一些新的化合物。如培養基水活度從0.99下降至0.95時，雖然蘑菇醇、芳樟醇、2-乙基己醇和三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇等成分的含量下降明顯，但也產生了橙花醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和二氫-α-紫羅蘭酮等成分。另外，水活度也影響真菌發酵后茶湯中的咖啡因含量，低水活度條件下，茶湯中咖啡因的含量逐漸下降。試驗結果表明，通過調節發酵液(培養基)的水活度，可以調控真菌發酵后茶湯的香氣成分和含量。

冠突散囊菌是我國特有茶類-黑茶，尤其是茯磚茶產品中的優勢微生物，并作為對人體有益的微生物而成為茶葉產品的一部分[1, 3, 28]。利用冠突散囊菌的不同菌株作為人工發酵菌劑生產不同的產品，在我國已有大量的研究[29-31]。冠突散囊菌適應于干燥和高滲透壓的環境，在一定的低水活度和干燥條件下生長更好，更能發揮其對茶葉成分的生物轉化效能。研究結果對促進冠突散囊菌的應用和茶葉深加工的發展有積極的意義。