香蓼精油成分及其生理活性分析

伍 燕， 田程飄， 向 霞， 申利群，3*

(1.興義民族師范學(xué)院， 貴州 興義 562400； 2.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 廣西 南寧 550006； 3.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室, 廣西 南寧 550006)

香蓼(Polygonumviscosum)為蓼科蓼屬植物，又名辣柳、辣辣草，為一年生草本植物[1]，其葉片和莖散發(fā)出一種特殊香味。西南地區(qū)的少數(shù)民族非常喜愛其香味，如云南的彝族將香蓼葉切碎與搗碎的蜂蛹拌食，貴州布依族在食用牛羊狗肉時將香蓼添加在蘸水中，苗族在酸湯魚的烹飪中用香蓼葉佐食，土家族利用香蓼葉散發(fā)的揮發(fā)性物質(zhì)來熟化柿子。香蓼全草可藥用，具有發(fā)汗、除濕和消食的功效，其獨特的辛辣味和微澀味不僅能掩蓋肉類的腥味，還能刺激味蕾、激發(fā)食欲。

香蓼全草主要含黃酮類、揮發(fā)油類、鞣制類[2]，目前研究集中在對香蓼總黃酮的提取工藝及成分分析上，對香蓼精油活性研究較少[3]。興義地處溫潤多雨的亞熱帶，大陸性季風(fēng)氣候明顯，周邊水庫及低洼濕地多，野生香蓼豐富，且香味濃烈，但當(dāng)?shù)匾吧戕べY源的開發(fā)利用目前還是一片空白。為此，筆者等以貴州興義的野生香蓼為試驗材料，采用水蒸氣蒸餾法提取香蓼精油，采用GC-MS對精油揮發(fā)性成分進(jìn)行定量和定性分析，檢測香蓼精油對多種自由基的清除作用及其對幾種常見細(xì)菌和真菌的抑菌作用，探索香蓼精油對農(nóng)作物害蟲玉米粘蟲的趨避活性，并作出評價，旨在為興義香蓼精油的開發(fā)利用和推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

樣品：興義野生香蓼，采集于貴州興義萬峰湖低洼處。

試驗菌株：金黃色葡萄球菌(CMCC-26069)，枯草芽孢桿菌(ATCC-6633)、大腸桿菌(ATCC-8739)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC-4532)、熱帶假絲酵母菌(ATCC-13803)、白色念珠菌(ATCC-10231)，分別從CMCC和ATCC購入。

玉米粘蟲：購于河南省濟源白云實業(yè)有限公司。

儀器與試劑：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010 Plus，日本島津公司；水蒸氣蒸餾裝置，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；Thermo Scientific Multi-skan FC酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司；HVS-1000超凈工作臺，江蘇蘇凈安泰；YXQ-75SII高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊。2,2′- 聯(lián)氨 -雙( 3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二胺鹽(ABTs)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，麥克林試劑公司；水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇和二甲基亞砜、丙酮酸，國藥集團。

1.2方法

1.2.1樣品制備稱取新鮮香蓼500 g于2 L圓底燒瓶中，加入1.5 L純凈水，蒸餾時間4 h，經(jīng)水蒸氣蒸餾收集得到香蓼精油[4]。

1.2.2GC-MS分析條件

1) 色譜條件。HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，載氣為高純氦氣，流速為1.45 mL/min，分流比50∶1，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度280℃，程序升溫為柱溫80℃，以3℃/min的速率升至240℃。

2) 質(zhì)譜條件。電子轟擊(EI)能量70 eV，離子源溫度220℃，接口溫度250℃，溶劑延遲2 min，全掃描，質(zhì)量掃描范圍為50～400 m/z[5]。質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫為NIST MS。

1.2.3抑菌試驗參照文獻(xiàn)[6]并略作修改，采用0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁法，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB)，真菌用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)，用對應(yīng)培養(yǎng)基調(diào)整各菌液濃度到1×105cfu /mL待用。準(zhǔn)確稱取250 mg香蓼精油，用二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為0.25 g/mL的母液，用LB或PDB稀釋100倍濃度為2 500 μg/mL的工作液。采用對倍稀釋法，取無菌96孔板，第一孔和第二孔各加濃度為2 500 μg/mL母液100 μL，第一孔不變，第二孔加100 μL的LB培養(yǎng)基對倍稀釋，混勻后吸取100 μL到第三孔，依次重復(fù)到第十一孔，使香蓼精油濃度依次為2 500 μg/mL、1 250 μg/mL、625 μg/mL、312.5 μg/mL、156.25 μg/mL、78.12 μg/mL、39.06 μg/mL、19.53μg/mL、9.76 μg/mL、4.88 μg/mL和2.44 μg/mL，再往每孔中加入100 μL濃度為1×105cfu /mL菌液，以LB(真菌用PDB)培養(yǎng)基為空白對照。細(xì)菌置于30℃、真菌置于28℃中培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)結(jié)束后比較試驗組與對照組渾濁度差異，肉眼觀察到的未渾濁的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)，不同處理3次重復(fù)。

1.2.4抗氧化活性試驗

1) 香蓼精油工作液配制。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，準(zhǔn)確稱取20 mg香蓼精油，用無水乙醇定容至1 mL，無水乙醇依次稀釋成10 mg/mL、8 mg/mL、6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL和1 mg/mL，待用。

2) ABTs自由基清除試驗。取96孔板，依次加入不同濃度香蓼精油50 μL，加入150 μL的ABTs工作液，混勻、避光靜置6 min后，在734 nm波長處測定吸光度值，記作Ai(樣品吸光度值)；取精油不同濃度樣液50 μL，以ddH2O代替ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作Aj(樣品本底吸光度值)；取50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，同法測定吸光度值，記作A0(陰性對照)，每個濃度3次重復(fù)。ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

3) DPPH·自由基清除試驗。取96孔板，依次加入不同濃度香蓼精油100 μL，加入0.1 mmol/L DPPH工作液100 μL，混勻、避光靜置30 min，在517 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，記作Ai(樣品吸光度值)；另取不同濃度樣液100 μL加入無水乙醇100 μL，同法測定吸光度，記為Aj(樣品本底吸光度值)；另取無水乙醇 100 μL加入DPPH工作液100 μL，測定吸光度記為A0(陰性對照)；以Vc為陽性對照。3次重復(fù)。DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

4)·OH自由基清除試驗。取不同濃度樣液100 μL，依次加入9.0 mmol/L水楊酸乙醇溶液100 μL、9.0 mmol/L FeSO4溶液100 μL、8.8 mmol/L H2O2溶液100 μL啟動反應(yīng)，混勻后37℃水浴30 min，取200 μL各樣液在510 nm波長處測定吸光度，記為Ai(樣品吸光度值)；另以ddH2O代替樣液，同法測定，記為A0(陰性對照)；以Vc為陽性對照。3次重復(fù)。·OH清除率=[ A0-Ai]/A0×100%。

1.2.5香蓼精油對玉米粘蟲幼蟲拒食活性的測定采用小葉蝶添加法[8]。挑選建康成長的2～3齡玉米粘蟲，保持饑餓狀態(tài)6～8 h后，置于潔凈的培養(yǎng)皿中，用丙酮稀釋香蓼精油成5個濃度。不同濃度精油分別為0.2 mL/mL、0.1 mL/mL、0.05 mL/mL、0.025 mL/mL 和0.012 5 mL/mL；將新鮮玉米葉剪成邊長為3 cm的正方形，將其浸泡于不同濃度香蓼精油中2～3 s后取出，待溶劑揮發(fā)干后，置于放有試蟲的培養(yǎng)皿內(nèi)，對照組用丙酮代替精油。分別在6 h、12 h、24 h和48 h后，用坐標(biāo)方格紙測量拒食面積并計算拒食率，3次重復(fù)，求其平均值。拒食率=[(對照組取食面積-處理組取食面積)/對照組取食面積]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1香蓼精油成分

對圖1進(jìn)行分析可知，香蓼精油共鑒定出32種揮發(fā)性化學(xué)成分，占總質(zhì)量的96.01%，其中含量為1%以上成分的有10種，分別為十二烷醛(24.57%)、葵醇(12.08%)、異長葉烯(9.39%)、葵烷(8.14%)、蛇麻烯(5.87%)、石竹烯氧化物(3.05%)、石竹烯(2.36%)、補身醇(2.17%)、倍半香檜烯(1.44%)和α-橄欖烯(1.3%)，這10個成分占精油色譜出峰面積的70.37%(表1)。

圖1香蓼精油GC-MS 總離子流圖

Fig.1 TIC chromatogram of GC-MS of essential oil fromP.viscosum

表1香蓼精油成分及含量

2.2香蓼精油的抑菌作用

從表2可知，香蓼精油對幾種常見細(xì)菌及真菌具有一定的抑制作用。香蓼精油對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果較好，其MIC值分別為4.88 μg/mL和39.06 μg/mL；對金黃色葡萄球菌的MIC值達(dá)78.12 μg/mL。可見香蓼精油對抑制細(xì)菌生長的效果較好，對真菌也有一定抑制活性，但MIC值都較細(xì)菌的高，熱帶假絲酵母、白色念珠菌和肺炎克雷伯氏菌的MIC值均在1 250 μg/mL以上。

表2不同濃度香蓼精油對細(xì)菌及真菌的抑菌表現(xiàn)

注：“-”表示澄清；“+”表示略渾濁；“++”表示十分渾濁。

Note: "-" means clarification; "+" means slightly turbid; "++" means very turbid.

2.3香蓼精油的抗氧化活性

由圖2可知，香蓼精油對ABTs、DPPH和·OH自由基的清除率隨香蓼精油濃度的升高呈量效關(guān)系。對ABTs的清除率表現(xiàn)較好，在香蓼精油濃度為1 ～ 4 mg/mL時，對ABTs自由基的清除作用上升較快，在4～ 10 mg/mL上升趨勢變緩，在10 mg/mL時清除率可達(dá)到88%左右，隨著濃度的增加對ABTs自由基的清除能力逐漸趨同于Vc，EC50(半數(shù)效應(yīng)濃度)為3.20 mg/mL。香蓼精油對DPPH自由基的清除率隨精油濃度的增加上升比較平緩，其EC50為10.87 mg/mL。香蓼精油對·OH自由基的清除率隨精油濃度的增加逐漸上升，其EC50為10.24 mg/mL。

圖2香蓼精油和Vc 對 ABTs、DPPH及 OH自由基的清除率

Fig.2 Scavenging rates of essential oil fromP.viscosumand Vc on ABTs, DPPH, and OH free radicals

2.4香蓼精油對玉米粘蟲的拒食活性

從表3可知，不同濃度的精油對玉米粘蟲均具有拒食作用，尤其在6 h拒食活性均達(dá)到80%以上，說明玉米粘蟲對揮發(fā)油中的成分較敏感。當(dāng)香蓼精油的濃度為0.1 mL/mL，48 h后拒食率仍然達(dá)到90%以上，可見高濃度香蓼精油表現(xiàn)出較強的驅(qū)蟲活性。

表3不同濃度香蓼精油對玉米粘蟲的拒食率

3結(jié)論與討論

香蓼精油揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析可知，其主要成分有十二烷醛(24.57%)、葵醇(12.08%)、異長葉烯(9.39%)、葵烷(8.14%)、蛇麻烯(5.72%)、石竹烯氧化物(3.05%)、石竹烯(2.36%)、補身醇(2.17%)、倍半香檜烯(1.44%)、α-橄欖烯(1.3%)、香樹烯(0.86%)、姜黃烯(0.29%)和月桂烯(0.04%)等具有香味和辛辣刺激性的化合物。香蓼精油具有良好的抗氧化活性，其對ABTs自由基的清除效果顯著，EC50為3.20 mg/mL，對DPPH自由基和·OH自由基也有較好的清除效果，其EC50分別為10.87 mg/mL和10.24 mg/mL。

抑菌和拒食活性試驗表明，香蓼精油對常見細(xì)菌和真菌均具有一定程度的抑制生長作用，對細(xì)菌類的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌作用明顯，其MIC值分別為4.88 μg/mL和39.06 μg/mL，對真菌類微生物有一定抑制作用，但所需精油濃度較高，均在1 250 μg/mL以上。香蓼精油對玉米粘蟲表現(xiàn)出較好的拒食活性，在0.012 5～0.2 mL/mL，前6 h均表現(xiàn)出對玉米粘蟲80%以上拒食活性。

香蓼特殊的香辛味來自于其揮發(fā)性成分，相關(guān)研究表明[9-11]，十二烷醛具有強烈的脂肪香氣；葵醇具有蠟香、花香味；異長葉烯是一種倍半萜烯，具有木香香氣；葵烷具有刺激作用；蛇麻烯又稱α-石竹烯或葎草烯，是一種天然的單環(huán)萜烯，其水解產(chǎn)物是產(chǎn)生啤酒特殊香氣的關(guān)鍵物質(zhì)；石竹烯又稱β-石竹烯，是一類雙環(huán)倍半萜類化合物，有辛香、木香、柑橘香、樟腦香及丁香香氣；倍半香檜烯在胡椒香氣揮發(fā)物中存在，具有辛香味。這些氣味的綜合形成了香蓼獨特的香味，在貴州民間飲食調(diào)味上占據(jù)了一席之地，不僅老百姓愛食用，在貴州遵義國酒董酒的酒曲制作過程中香蓼也是必不可少的重要原料，適當(dāng)添加香蓼對酵母質(zhì)量具有良好的促進(jìn)作用[12-13]，其中脂肪酸類可以促進(jìn)釀酒酵母的增殖活性[14]，目前香蓼在遵義市已有大面積種植以滿足生產(chǎn)需要。

從GC-MS成分分析可知，倍半萜類化合物是香蓼重要的次生代謝產(chǎn)物，由石竹烯、倍半香檜烯、蛇麻烯、石竹烯氧化物、姜黃烯、補身醇、臭根醇和蛔蒿素等構(gòu)成，相關(guān)研究表明[15]，具有倍半萜成分的沃伯格醛(warburganal)具有明顯的殺菌活性，倍半萜類成分的8,9-二醛基和7,8位不飽和的Drimane骨架化合物，對昆蟲具有很強的拒食活性和趨避活性[16]，研究表明香蓼精油具有豐富的倍半萜類化合物成分[17]，在植物病原菌及病害防治上具有一定的應(yīng)用前景，香蓼精油對不同自由基有良好的清除作用，可作為天然抗氧化試劑進(jìn)行開發(fā)與利用。