茶樹內生真菌的分離及廣譜抑菌菌株的篩選鑒定

劉詩詩

(廣西壯族自治區桂林茶葉科學研究所， 廣西 桂林 541001)

植物內生真菌(endophyte)是指生活史的部分或全部階段生活于健康植物各個組織和器官內部的真菌[1]。植物內生真菌可以產生與其宿主植物相同或相似的生理活性成分以及特殊活性物質，這些真菌對宿主植物幾乎無害，與植物形成相互依存的共生關系或不太密切的共生關系[2]。近年來，一些具有特異功能的內生菌不斷從植物中被分離出來，如高原等[3]從蒲公英中分離出內生真菌中菌株 PGY5對金黃色葡萄球菌有較強的抑制效果，其最小抑菌濃度值約為0.16 mg/mL，最小殺菌濃度值約為0.31 mg/mL，且對其他植物病原菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等也具有較明顯的抑菌作用；施蕊等[4]從滇重樓中分離出98株內生真菌，其中部分內生真菌對供試植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌等有一定的抑制作用，平均抑制率達82%以上，PPC-78對尖孢鐮刀菌的抑制作用較為明顯，兩菌對峙試驗時，抑制率高達100.00%，其發酵液的抑制作用也達83.11%。

中國是茶葉生產和貿易的發源地，茶葉一直是我國重要的經濟作物之一。國內對茶葉進行的研究主要集中在茶葉品質、栽培、組培、病蟲害防治等[5]方面，近幾年來，因為農藥殘留新標準的實施，對茶樹病蟲害的防治提出了新要求，越來越多的學者對防治茶樹病蟲害的同時又能提高茶葉品質進行了相關研究。目前已有研究表明，茶樹各個組織內存在著獨特的內生微生物菌群[6]，從這些內生菌群中已成功分離出能抑制茶病原菌的菌株，如胡淑霞[7]從茶樹中分離出的芽孢桿菌對茶赤葉斑病、茶白星病及茶煤病有一定的抑制作用，其抑制率分別為74.87%、65.69%、55.67%；蔡麗等[8]從茶樹中分離出的26株內生菌中，部分內生菌對枯草芽孢菌、金黃色葡萄球菌、梨腐爛病菌等有較強的抑制作用；姜微等[9]從油茶健康葉片中分離1株解淀粉芽孢桿菌J-3-1，該菌株對茶根腐病菌、葉枯病菌、炭疽病菌及軟腐病菌均有拮抗活性，其抑菌圈半徑分別為12.5 mm、16.8 mm、13.5 mm、13.4 mm。因此，筆者等從茶樹不同組織器官中分離、純化內生真菌，并對其進行初步的抑菌活性試驗及其發酵液抑菌活性研究、鑒定，以期為應用茶樹內生真菌資源防治病害奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物茶樹品種為桂香18號，茶樹根、莖、葉由廣西桂林茶葉研究所提供。

1.1.2供試病原菌病原菌分別為火龍果黑斑病菌〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp)、芒果蒂腐菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)、小麥赤霉病菌(FusaHumgraminearumSehw)、蘋果輪紋病菌(Botrysphuaeriaberengerianaf.sp.piricola)、番茄早疫病菌(Altemariasolani)和芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioiles)，均由海南大學熱帶農林學院農藥實驗室提供，4℃保存備用。

1.1.3培養基

1) PDA培養基。去皮的200 g馬鈴薯切小塊，加水煮沸直到土豆完全熟透，然后用4層紗布過濾后加入20 g葡萄糖、18 g瓊脂，再定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。分裝時100 mL培養基中加入100 μL抗生素，即抗生素的添加比例為1%。

2) 孟加拉紅培養基。31.6 g孟加拉紅，28 g瓊脂，加水煮沸至完全溶解，再定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。分裝時加入1%的抗生素。

1.1.4試驗儀器電子天平(CAV213C，奧豪斯儀器(上海)有限公司)、超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司)、數顯多孔恒溫水浴(BA-8，常州國華電器有限公司)、生化培養箱(SPX-280，寧波江南儀器廠)、微波爐(WD900G，佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司)、雙人超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司)、凝膠電泳擴增儀(DYY-6B，北京六一儀器廠)、微生物搖床培養箱(ZHWY2102C，廣東康恒儀器有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(LD2X-30KA，上海申安醫療機械廠)。

1.2茶樹內生真菌的分離及純化

取茶樹的根、莖、葉，用水沖洗干凈去泥土，晾干。參照施蕊等[4]的方法進行表面滅菌，即用0.1%的升汞浸泡根8 min、莖5 min、葉3 min，無菌水反復沖洗；75%乙醇浸泡30 s，無菌水反復沖洗；處理完畢后在無菌條件下將根、莖、葉切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，分別放入PDA培養基中，做好標記，待培養基中有菌絲長出時，挑取前端菌絲接于另一新配置的PDA培養基中央，反復進行該步驟以實現純化，最后將純化菌株接種到試管斜面保存備用。

1.3活化病原菌

在無菌條件下，用已滅菌的接種環挑取保藏在試管中的病原菌尖端菌絲接于PDA培養基中，置于28℃恒溫培養箱內培養備用。

1.4茶樹內生真菌的抑菌活性測定

采用平板對峙培養法[10]，在無菌條件下，用打孔器(直徑0.5 cm)沿著菌落邊緣打取菌餅，將植物內生真菌與植物病原菌菌餅接于PDA平板上，直線上的兩菌餅相距2.5 cm，同時以只接有內生真菌或病原菌的平板為對照，每個處理3次重復，置于28℃恒溫培養箱內培養，每隔24 h觀察1次菌落的生長情況，直到對照病原菌菌落長至平板的2/3時拍照并記錄生長情況，計算抑菌效果。根據內生菌株的抑菌率，選擇抑菌效果較好且廣譜性較強的菌株制備發酵液，并進行發酵液抑菌活性測定。

式中，DCK為對照組菌落半徑，D為處理組菌落半徑，0.25為初始菌餅半徑。

1.5優選內生真菌的生長速率測定

沿著菌落邊緣打菌餅，以菌絲朝下接入培養基上，置于28℃的恒溫培箱中培養，每隔24 h測量菌落半徑，記錄試驗結果，分析內生真菌生長規律。

1.6優選內生真菌的形態學和分子生物學鑒定

1.6.1形態學鑒定 在無菌條件下，將篩選出的菌株接種于PDA培養基中，用鑷子將已滅菌的蓋玻片斜插入培養基中，在光學顯微鏡下觀察該菌株的產孢結構、菌絲、孢子等形態特征，并拍照記錄。篩選菌株接種于PDA平板中，置于28℃恒溫箱中培養數天，觀察菌落大小、顏色、形態、邊緣等特征，依據《真菌鑒定手冊》對該菌株進行初步的鑒定[11]。

1.6.2分子生物學鑒定 從已培養好的篩選菌株平板中刮取內生真菌菌絲，按照CTAB法[12]提取內生真菌DNA，使用ITS1和ITS4通用引物進行PCR擴增，按照表1所示反應體系，PCR反應條件：94℃變性5 min、58℃復性1 min、72℃延伸1 min、30個循環，PCR產物在瓊脂糖(濃度為1 %)凝膠電泳，利用Goldview染色[13]對菌絲、孢子、分生孢子及孢子梗染色，經紫外分析儀觀察拍照并保存，擴增產物經真菌基因組DNA提取試劑盒[14]純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1茶樹內生真菌DNA的PCR擴增反應體系

Table 1 PCR amplification reaction system of endophytic fungus DNA from tea trees

物質名稱Material加入量/LAdding amountTemplate5Forward Primer1Reverse Primer110× Buffer52.5Mm dNTPs4DNA Polymerase1ddH2O33Total volume50

2結果與分析

2.1內生真菌的分離結果

從茶樹中分離出內生真菌24株，從根中分離出7株，從莖中分離出8株，從葉中分離出9株，分別命名為G-1～G-7、J-1～J-8、Y-1～Y-9，分離的菌株生長情況及菌落特征見表2。

2.2內生真菌的抑菌效果

從表3看出，24株內生真菌中，J-7對芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、蘋果輪紋病、火龍果黑斑病及番茄早疫病的抑制抑菌效果較好且廣譜性較強，抑制率分別為70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。

表2 茶樹內生真菌的生長情況及菌落形態

注：“+”表示生長情況較弱，“++”表示生長情況好，“+++”表生長情況較好。

Note: "+" indicates weak growth, “++” indicates good growth, and “+++” indicates perfect growth.

表3茶樹內生菌對各病菌的抑制率

注： G-1～G-7為茶樹根部內生真菌，J-1～J-8茶樹莖內生真菌，Y-1～Y-9茶葉內生真菌。同列數據后不同小寫字母表示差異達0.05的顯著水平。

Note:G-1～G-7 is an endophytic fungus at the root of tea tree, J-1～J-8 is an endophytic fungus at the stem of tea tree, and Y-1～Y-9 is an endophytic fungus in tea leaf. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3內生真菌J-7對植物病原菌的抑菌效果

從圖1看出，J-7對供試病原菌有明顯抑制作用，對番茄早疫病菌、火龍果黑斑病及蘋果輪紋病的抑制作用較為明顯。

2.4內生真菌J-7生長速率和形態學特征

茶樹內生真菌在PDA培養基上前5 d生長較快，6～9 d生長逐漸緩慢，10 d以后幾乎停止生長。

從圖2看出，J-7菌落近圓形，前期菌絲毛絨狀，白色，較致密，后期菌落底部中間呈褐色，凹凸不平，由內至外顏色逐漸變淺，有色素擴散圈。菌絲有明顯的隔膜，多分枝，孢子梗呈梢子狀，孢子呈鐮刀狀(圖3)。

圖1內生真菌J-7對各植物病原菌的抑菌效果

圖2J-7的菌落形態

圖3J-7的孢子梗(A)及菌絲(B)、孢子(C)形態

2.5內生真菌J-7分子生物學鑒定

從圖4看出，J-7基因組DNA經過PCR擴增后在750 bp左右得到清晰的PCR擴增產物帶。在GeneBank基因庫中進行其同源性搜索，發現J-7菌株與鐮刀菌屬ITS序列相似性接近于90%。綜合同源性比對結果和該鐮刀菌在真菌發育系統中的位置，從Genebank中選出7個菌株的ITS基因序列，應用軟件進行多重比較后構建系統發育樹(圖5)。從圖中看出，該菌株與鐮刀菌(Fusarium.sp)在一個分支中，與該菌株的進化距離最接近，初步將菌株J-7鑒定為鐮刀菌屬(Fusarium.sp )。

注：1，2為菌株J-7的DNA，M為Marker

Note: 1, 2 are DNA of strain J-7, M is Marker.

圖4J-7的PCR擴增產物帶

Fig.4 PCR products of J-7

圖5基于rDNA ITS序列的系統發育樹

3結論與討論

試驗采用普通的分離方法從茶樹的根、莖、葉不同組織中得到了24株內生真菌，有7株來源于根、8株來源于莖、9株來源于葉，結果與游見明等[15]從茶樹中分離出的32株內生真菌有一定差異，可能是研究材料的來源不同或筆者等的滅菌時間差異導致[16]。將24株內生真菌分別與火龍果黑斑病、香蕉枯萎病、芒果蒂腐病、小麥赤霉病、蘋果輪紋病、番茄早疫病、芒果炭疽病、芒果炭疽病進行拮抗活性測定，篩選出了1株來源于莖的內生真菌J-7，該菌株對參試大部分病原菌有明顯抑制效果，為廣譜性內生真菌，其對番茄早疫病的抑制效果較為明顯，對芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、蘋果輪紋病、火龍果黑斑病、番茄早疫病的抑制率分別為70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。采用形態學鑒定方法和分子生物學鑒定方法對J-7菌株進行初步的鑒定，該菌株屬鐮刀菌屬(Fusarium.sp)。