斑點叉尾鮰致病菌株的分離鑒定與藥敏特性

陶 莎， 姚俊杰， 商寶娣， 李小義， 張效平*

(1.貴州大學 漁業資源與環境研究中心， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農業科學院 水產研究所， 貴州 貴陽 550025)

斑點叉尾鮰(Ietaluruspunetatus)是一種大型淡水魚類，原產于北美洲，屬脊索動物門(Chordata)硬骨魚綱(Osteichthyes)鯰形目(Siluriformes)鮰科(Ictaluridae)，其具有生長快、食性雜、抗病力強和肉質上乘等優點，是我國重要的水產經濟魚類之一[1]。由于養殖集約化程度的不斷提高，使得斑點叉尾鮰的細菌病、病毒病及寄生蟲病的發生越來越頻繁，由細菌引起的疾病則是其中危害最嚴重的一類。目前，已從患不同病的斑點叉尾鮰中分離到嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)[2]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3-4]、魯氏耶爾森氏菌(YersiniaRuckeri)[5]、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)[6]和海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[7]等病原菌。2019年3月，貴州省錦屏縣某養殖場養殖斑點叉尾鮰發生強傳染性病害，導致大量斑點叉尾鮰死亡。為此，從發病病魚中分離出1株高致病性的致病菌Q1，通過細菌生化微量鑒定管鑒定、16S rDNA序列測定和系統發育分析方法對該菌進行分類鑒定,并測定其對45種常用抗菌藥物的敏感性，以期為生產上由該菌引起的斑點叉尾鮰病害防治提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗魚體長為15～20 cm的自然發病斑點叉尾鮰，采自貴州省錦屏縣某養殖場；人工回歸感染試驗所用的15～20 cm健康斑點叉尾鮰，采自貴州省遵義市綏陽縣風華鎮魚子孔養殖基地。

1.1.2試劑LB培養基、水解酪蛋白瓊脂板(MH)、LB營養肉湯、細菌生化微量鑒定管和藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，上海生物工程有限公司；PCR相關制品，TaKaRa Bio公司。

1.2方法

1.2.1發病癥狀觀察現場觀察病魚的攝食情況和行為特點等，將病魚放入白色的搪瓷盤中，檢查病魚體表病變、腹部腫大和肛門腫脹等情況；解剖后觀察其肝、腎和腸等器官的病變反應。

1.2.2病原菌的分離與純化選取患有典型病狀的斑點叉尾鮰，用75 %酒精擦拭病魚全身，在無菌條件下解剖，取其肝臟和腎臟的病灶組織，劃線接種于LB培養基上，28℃恒溫培養箱中培養24 h后，選取在培養基上數量較多、形態顏色一致的單菌落進行劃線純化培養，28℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察記錄菌落的大小、形態及顏色等形態特征；參照文獻[8]的方法，對Q1菌株進行革蘭氏染色等24項生理特性的檢測；挑取純化后的單菌落置于營養肉湯中，28℃搖床培養18 h后，加入50%甘油混勻，-80℃保存備用。

1.2.3回歸感染試驗無菌條件下，取保存于-80℃的Q1菌株劃線接種于LB平板上，28℃培養24 h后，用無菌PBS緩沖液將LB平板上的菌落沖洗于無菌EP管中，反復沖洗3次后，按麥氏比濁法將菌液濃度配制成1×109cfu/mL，并進行10倍梯度稀釋，分別得到濃度為1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL和1×105cfu/mL的菌液；健康斑點叉尾鮰暫養1周后隨機按每組30尾分成6個組，每組為1個處理，設1個對照(CK)，共計6個處理：處理1，0.5 mL 1×109cfu/mL；處理2，0.5 mL 1×108cfu/mL；處理3，0.5 mL 1×107cfu/mL；處理4，0.5 mL 1×106cfu/mL；處理5，0.5 mL 1×105cfu/mL；CK，0.5 mL 0.65%滅菌PBS溶液；各處理均采用腹腔注射法，3次重復。試驗水溫為15～18℃；連續觀察7 d，記錄死亡情況，并計算1周后的死亡率與半數致死濃度(LD50)。同時取人工感染瀕死斑點叉尾鮰肝臟和腎臟病灶進行細菌的再分離培養與鑒定。

1.2.4分子鑒定及序列分析Q1菌株接種于營養肉湯中，28℃搖床培養18 h，11 000 r/min離心1 min收集菌體，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細菌總DNA，作為PCR的模板DNA；試驗引物為細菌16S rDNA通用引物：27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；PCR反應擴增體系總體積50 μL，包括去離子水(ddH2O)37.5 μL，10× buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Ex Taq 0.5 μL，上下游引物各1 μL(20 μg/L)，模板DNA 1 μL(濃度80 μg/L)；PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環；最后再于72℃延伸10 min。

采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的目的條帶，而后送樣進行PCR產物測序，得出結果利用SeqMan和Bio Edit等進行分析，并與GenBank收錄的其他細菌的16S rDNA基因序列進行相似性對比，利用MEGA 6.0計算各序列間的相對遺傳距離，并通過鄰接法(Neighbor joining，NJ)構建系統發育樹，系統樹各分支的置信度由Bootstrap 1000循環檢驗給出。

1.2.5抗菌藥物敏感試驗Q1菌株接種于營養肉湯中，28℃搖床培養18 h后，吸取500 μL菌液，均勻涂于MH培養基中，待菌液吸收后，無菌條件下，采用紙片擴散法(K-B法)，將45種藥敏紙片均勻貼于培養基中，每種抗菌藥物3次重復，相同形狀的滅菌濾紙片作為對照(CK)，置于28℃恒溫培養箱中培養24 h后測量抑菌圈直徑。

1.3數據處理

采用Excel 2010和SPSS 13.0對數據進行處理與分析。

2結果與分析

2.1病魚癥狀

患病魚游動緩慢，離群或靠邊獨游，體表呈褪色斑，直至發生潰瘍；食欲減退，甚至喪失；鰭條邊緣發白，基部、下頜和腹部等部位充血或出血；肛門紅腫、外凸，嚴重時有脫肛現象；解剖可見淡黃色或含血腹水；胃腸道無食物，腸道發生異常蠕動或痙攣，部分魚后腸出現1～2個腸套疊；肝臟腫大變色，膽囊擴張，部分魚鰾充血或出血。

2.2菌株形態及生理生化特征

Q1菌株經28℃恒溫培養24 h后呈不透明的微隆起，淡黃色圓形，邊緣整齊，表面光滑，直徑0.8～1.2 mm；經革蘭氏染色顯示為革蘭氏陰性菌，短桿狀。從表1看出，Q1菌株甲基紅為陽性、V-P試驗和硫化氫為陰性，均與魯氏耶爾森氏菌一致；賴氨酸Q1菌株為陽性，魯氏耶爾森氏菌陽性反應超過24 h；果糖和蜜二糖Q1菌株為陽性，魯氏耶爾森氏菌為陰性；其余項目Q1菌株的特征與魯氏耶爾森氏菌一致。

表1 Q1菌株與魯氏耶爾森氏標準菌株的生理生化特征

注：+表示陽性，-表示陰性，++表示陽性反應超過24 h。

Note:+, Positive; -, Negative; ++, The time of positive reaction exceeds 24 h.

2.3回歸感染試驗

經人工回歸感染的斑點叉尾鮰觀察發現，瀕死魚游動緩慢，單獨離群，體表有出血點,解剖腹腔有少許腹水，腸道與胃中充滿液體(圖1a、b)，有腸套疊和腸結節等癥狀(圖1c、e)，腎臟腫大(圖1d、f)，部分魚腸道和鰾出現充血或出血癥狀(圖1g)，與自然發病的斑點叉尾鮰病變相似。從人工感染死亡魚的肝臟和腎臟組織分離到與Q1菌株形態、生理生化特性、16S rDNA序列分析一致的細菌，表明Q1菌株是2019年3月貴州省錦屏縣某養殖場養殖斑點叉尾鮰發生的強傳染性病害的病原菌。

從表2看出，健康斑點叉尾鮰在接種Q1菌株感染不同時間后的死亡數變化。1～2 d：隨著接種Q1菌株濃度的降低，斑點叉尾鮰的死亡數呈下降趨勢，1 d時處理1死亡21尾，處理4死亡2尾，處理5和CK無死亡；2 d時處理1死亡6尾，處理4死亡1尾，處理5和CK無死亡；3～4 d：處理1～4斑點叉尾鮰的死亡數無規律性，處理5和CK無死亡；5～7 d：所有處理斑點叉尾鮰均未死亡。1周時死亡率，處理1死亡率最高，為100%；處理2其次，為70%；處理5和CK為0；菌株Q1對斑點叉尾鮰的半數致死濃度為1.05×107cfu/mL。

注：a、b為胃與腸道中充滿液體，c為腸套疊，d為魚鰾充血，e為腸道結節；a～d病魚感染時菌液濃度為1×107cfu/mL，e～g病魚感染時菌液濃度為1×109cfu/mL。

Note:a and b, fluid-filled stomach and intestinal; c, indigitation; d, bloodshot bladder; e, intestinal nodules; a-d, the fish infected with Q1strain with 1×107cfu/mL; e-g, the fish infected with Q1strain with 1×109cfu/mL.

圖1回歸感染斑點叉尾鮰的癥狀

Fig.1 Symptoms ofI.punetatusinfected with Q1strain

表2Q1菌株對斑點叉尾鮰感染試驗

2.4PCR擴增與序列分析

從圖2看出，Q1菌株的16S rDNA序列區通過PCR擴增，產物經1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，得到1條長度約1 400 bp的目的產物；與GenBank中已有的16S rDNA序列進行同源性對比顯示，Q1菌株的16S rDNA序列與已有的魯氏耶爾森氏菌同源性達99%以上，通過MEGA6.0鄰接法建立的系統發育樹(圖3)顯示，Q1菌株與魯氏耶爾森氏菌(MK396587.1、AB681666.1、HQ222844.1、FJ908709.1)聚為一支，置信度為86，確定致病菌Q1為魯氏耶爾森氏菌，其GenBank登錄號為MN709091。

M:DL-2000 Marker；1.Q1菌株。

M:DL-2000 Marker；1.Q1strain.

圖2Q1菌株的16S rDNA區 PCR擴增結果

Fig.2 PCR amplified results of 16S rDNA of Q1strain

圖3Q1菌株的16S rDNA基因序列構建的系統發育樹

Fig.3 Phylogenetic dendrogram of Q1strain based on 16S rDNA gene sequence

2.5藥物敏感性

從表3可知，Q1菌株對慶大霉素、鏈霉素和大觀霉素等17種藥物為高度敏感，對阿奇霉素、頭孢克肟和新生霉素等6種抗菌藥物為中度敏感；對克拉霉素、紅霉素和麥迪霉素等等22種抗菌藥物耐藥。且Q1菌株對選用的氨基糖苷類、四環素類和喹諾酮類3種類型的抗菌藥物全部敏感，因此，此次貴州省錦屏縣某養殖場養殖斑點叉尾鮰發生的強傳染性病害可優先選用氨基糖苷類、四環素類和喹諾酮類抗菌藥物進行治療。

表3 Q1菌株對不同藥物的敏感性

注：R為耐藥；I為中度敏成；S為敏。

Note:R indicates resistance to antibiotic agent;I indicates medium sensitivity to antibiotic agent;S indicates sensitivity to antibiotic agent.

3結論與討論

魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)為腸桿菌科(Eenterobacteriaceae)耶爾森氏菌屬(Yersinia)兼性厭氧革蘭氏陰性菌。自20世紀 50年代，魯氏耶爾森氏菌在美國人工養殖的虹鱒中首次發現[9]，大量研究表明，魯氏耶爾森氏菌對魚類具有廣泛的致病性。我國已發現的易感品種包括斑點叉尾鮰[5]、鱘、金魚、鰻、羅非魚[10]、虹鱒[11]和鰱鳙[12]等，其感染的宿主范圍不斷擴大。感染魯氏耶爾森氏菌不同種病魚之間存在一些相同癥狀，如，嘴部出血、腸道腫脹發炎、內臟器官充血或出血、泄殖腔充血外凸等[5-7，9-11]。研究結果表明，患病斑點叉尾鮰也存在類似表征；但不同種魚之間由魯氏耶爾森氏菌引起的癥狀也存在差異，如，河北患病的施氏鱘其心臟呈花斑狀[10]，解剖由魯氏耶爾森氏菌致病的斑點叉尾鮰發現，胃內充滿大量濃稠的白色粘液[5]。該研究中，解剖由魯氏耶爾森氏菌致病的斑點叉尾鮰發現，腸道發生異常蠕動和痙攣，部分魚后腸出現1～2個腸套疊的現象，魚鰾充血或出血等異于其他患病魚的癥狀，由同種細菌引起的病魚不同癥狀可能與魚類不同種屬、不同水域及魚類自身的特性有關。

研究結果表明，同一批經人工回復感染后的斑點叉尾鮰可能存在不同的發病癥狀，有內臟不充血，腸道與胃內充滿液體，出現腸套疊，腎臟輕微紅腫等癥狀；有腸道和魚鰾等器官充血明顯，腎臟嚴重紅腫等癥狀。這可能是由于回復感染時所使用的菌液濃度不同以及魚體自身免疫系統的差異引起的。

通過生理生化特性鑒定和分子遺傳學鑒定2種方法對斑點叉尾鮰的病原菌進行鑒定，避免了因1種方法試驗誤差等造成鑒定結果不準確[13]。研究結果表明，在生理生化指標中，分離到的Q1菌株在賴氨酸、果糖和蜜二糖3個指標上與魯氏耶爾森氏菌標準菌株存在差異，其余指標均與標準株一致；并且分離株的16S rDNA序列與魯氏耶爾森氏菌同源性達99%以上。因此，結合2種鑒定方法結果，確定該菌為魯氏耶爾森氏菌。

研究結果表明，Q1菌株對45種常見抗菌藥物的敏感性結果與其他學者的研究略有所不同。如，范方玲等[5]在斑點叉尾鮰病魚中發現，魯氏耶爾森氏菌對氯霉素敏感，對慶大霉素、妥布霉素、新霉素和多粘菌素B耐藥；而Q1菌株對氯霉素耐藥，對慶大霉素、妥布霉素、新霉素和多粘菌素B敏感；連浩淼[11]在虹鱒病魚中發現，魯氏耶爾森氏菌對復方新諾明敏感，Q1菌株對其耐藥；楊昆明等[13]在西伯利亞鱘病魚中發現，魯氏耶爾森氏菌對氟苯尼考和頭孢他啶敏感，Q1菌株對其耐藥等。產生藥敏特性差異的原因可能是因為宿主種類、水域、藥敏片劑量、養殖模式和地區用藥習慣等有關。這也得到提醒，在防治細菌性疾病時，首先要通過藥敏試驗，準確篩選出有效抗菌藥物是防治該病的關鍵。Q1菌株對慶大霉素、鏈霉素和大觀霉素等17種藥物高度敏感，且對選用的氨基糖苷類、四環素類和喹諾酮類3種類型的抗菌藥物全部敏感，所以在藥物選擇上可優先選用氨基糖苷類、四環素類和喹諾酮類抗菌藥物進行治療。研究結果為貴州地區養殖斑點叉尾鮰感染魯氏耶爾森氏菌的防治提供了科學依據，并且通過不同種類有效抗菌藥物的交替使用，還可延緩致病菌耐藥性的產生。