斑點叉尾潰爛癥的病原鑒定和致病特性

許曉牧,陶敏慧,韓 陽，徐婷婷,樊慧敏,唐慶權,彭開松,劉天龍,田紀景,佘銳萍,朱若林,鮑傳和

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，水生健康與公共衛(wèi)生實驗室，合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆蛋白胨肉湯(TSB)、含0.1%考馬斯亮藍(CBB)的胰蛋白胨大豆蛋白胨瓊脂(TSA)、水解酪蛋白胨(MH)、水解酪蛋白胨瓊脂(MHA)、藥敏紙片、微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。Taq DNA聚合酶購自北京康為世紀生物科技有限公司。DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司?？股貥藴势焚徸灾袊F藥監(jiān)察所。PCR引物合成和基因測序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成。

1.2 臨床診斷分析

2018年3月18日和3月27日兩次到達現(xiàn)場，通過病史詢問、水質分析、飼料等投入品檢查、體表和鰓的寄生蟲檢查，進行初步的臨床診斷。

1.3 細菌分離純化

1.4 細菌鑒定

純化菌分別在MHA、含0.1%的考馬斯亮藍(CBB)的TSA上，25 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑單菌落進行革蘭氏染色和生理生化指標測定。以純化菌落為模板，參考朱若林等[11]方法擴增16S rRNA，并進行系統(tǒng)進化分析。

1.5 溫度對分離株世代時間的影響

參考 Prescott等[12]方法，測定分離菌分別在15 ℃和25 ℃的TSB中培養(yǎng)的世代時間。

1.6 代表性毒力基因檢測

參考朱若林等[11]方法分別檢測嗜溫性氣單胞菌的代表性毒力基因,包括氣溶素(aerA)、細胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)、熱穩(wěn)定性腸毒素(Ast)、溶血素(hlyA)、鞭毛(Fla)、核酶(Exu)、絲氨酸蛋白酶(Ser)、彈性蛋白酶(ahyB)、酯酶(Lip)。參考文獻[13，14]檢測嗜冷性氣單胞菌的代表性毒力基因，包括毒力陣列蛋白基因(vapA)、甘油磷脂膽固醇?；D移酶(GCAT)。

1.7 動物回歸感染

1.8 藥敏試驗

參考歐盟標準[16]，采用K-B紙片擴散法及MIC肉湯稀釋法進行抗菌藥物的藥敏試驗。

2 結果

2.1 臨床診斷

2.2 細菌的分離純化和鑒定

分離的4株細菌，在MHA上25 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓形、表面光滑、邊緣整齊、半透明狀凸起的灰白色菌落。含0.1% CBB的TSA上生長的菌落為白色，不產(chǎn)色素。分離菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短直桿菌。生理生化鑒定結果見表1。

PCR擴增分離菌的16S rRNA基因，得預期大小條帶，切膠回收后測序，分別得到1 431 bp、1 429 bp、1 425 bp和1 432 bp的基因序列。BLAST比對顯示， X-G1與殺鮭氣單胞菌無色亞種(HQ283362.1)、X-P2和X-P3與殺鮭氣單菌殺鮭亞種(KF751724.1)、X-P4與嗜水氣單胞菌(MG428972.1)的相似性最高，分別為99%、96%、99%和99%。綜合菌體形態(tài)、生理生化鑒定、16S rRNA基因序列和系統(tǒng)進化分析(圖1)，可確定X-G1為殺鮭氣單胞菌無色亞種、X-P2和X-P3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種，且均為非典型殺鮭氣單胞菌；X-P4為嗜水氣單胞菌。

表1 菌株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4的生理生化特征Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of strains X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

圖1 基于16S rRNA基因構建的 X-G1株，X-P2株，X-P3株和X-P4株系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

2.3 溫度對細菌生長的影響

殺鮭氣單胞菌X-G1、X-P2和X-P3在15 ℃的世代時間分別為14.2、13.9、14.1 min，均小于嗜水氣單胞菌X-P4的世代時間20.2 min；而在25 ℃培養(yǎng)時，殺鮭氣單胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代時間分別為20.2、19.6、20.9 min，均大于X-P4的世代時間15.5 min。

2.4 代表性毒力基因的檢測

對嗜溫氣單胞菌的10種代表性毒力基因檢測結果見圖2，殺鮭氣單胞菌無色亞種X-G1株可檢到彈性蛋白酶(ahyB)和溶血素(hlyA)；殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P2株可檢到彈性蛋白酶(ahyB)；殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株可檢測到彈性蛋白酶(ahyB)、溶血素(hlyA)、細胞毒性腸毒素(Act)、絲氨酸蛋白酶(Ser)、酯酶(Lip)和氣溶素(aerA)；嗜水氣單胞菌X-P4株可檢到鞭毛(Fla)、彈性蛋白酶(ahyB)、氣溶素(aerA)、細胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)、絲氨酸蛋白酶(Ser)和溶血素(hlyA)。對嗜冷氣單胞菌的2種代表性毒力基因檢測見圖3， 殺鮭氣單胞菌無色亞種X-G1株和殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株都可檢測到甘油磷脂膽固醇酰基轉移酶(GCAT)。4個分離菌株所攜帶的毒力基因不同(表2)。

圖2 X-G1、X-P2、X-P3和X-P4分離株毒力基因的PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4M：DNA分子質量標準DL2000；1：核酶；2：鞭毛；3：彈性蛋白酶；4：溶血素；5：細胞毒性腸毒素；6：熱不穩(wěn)定性腸毒素；7：熱穩(wěn)定性腸毒素；8：絲氨酸蛋白酶；9：酯酶；10：氣溶素；

圖3 X-G1、X-P2和X-P3分離株毒力基因的PCR擴增電泳圖Fig.3 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2 and X-P3M：DNA分子質量標準DL2000；1：毒力陣列蛋白基因2：甘油磷脂膽固醇?；D移酶

菌株嗜冷氣單胞菌毒力基因嗜溫氣單胞菌毒力基因殺鮭氣單胞菌無色亞種X-G1株GCATahyB、hlyA殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P2株—ahyB殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株GCATahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Lip嗜水氣單胞菌X-P4株 /ahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Fla、Alt

注：“—”表示未檢測到嗜冷氣單胞菌毒力基因；“/”示未進行此項檢測

2.5 動物回歸感染試驗

表3 水溫對分離菌株的半數(shù)致死濃度(LD50)的影響Tab.3 Effect of water temperature on the lethal concentration 50% of isolated strains CFU/g

表4 分離株混合感染對死亡率的影響Tab.4 Effect of co-infection on the mortality rate of the isolated strains %

2.6 抗菌藥物的藥敏試驗

紙片法和肉湯稀釋法的藥敏試驗均顯示分離株對多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考敏感(表5和表6)。

表5 抗菌藥物對分離菌株的抑菌效應 Tab.5 Antibacterial effect of antibiotics on the isolated strains

表6 抗菌藥物對分離菌株的最小抑菌濃度 Tab.6 Minimum inhibitory concentration of antibiotics on the isolated strains μg/mL

2.7 治療情況

介入診斷和治療時，大部分患病魚體表有創(chuàng)傷、潰爛、出血，并繼發(fā)水霉感染，從口腔到肛門均已經(jīng)發(fā)生嚴重的潰瘍。全池潑灑過碘制劑、水霉治療劑等外用藥。內服使用恩諾沙星等藥餌，但病魚對正常飼料和藥餌都已經(jīng)喪失食欲。最終，本病例治療以失敗告終。

3 討論

致病菌攜帶的毒力基因可能與其致病特性有關聯(lián)[13,14]。本研究中的4個分離菌株所攜帶毒力基因譜存在差異，且這3株非典型殺鮭氣單胞菌不同程度地攜帶有嗜溫氣單胞菌的代表性毒力基因。這與李紹戊等[14]從潰爛懷頭鯰分離的維氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的研究結果類似。非典型殺鮭氣單胞菌攜帶嗜溫氣單胞菌的某些毒力基因，可能與這些菌株的適應溫度或宿主范圍擴大有關[17]。

本研究治療以失敗告終，最后四個發(fā)病塘死亡率均為100%。綜合分析可知，患魚上一年的11月已發(fā)生該病，初步治療且水溫下降后，病情表面緩解，但大部分病魚體內病菌并未徹底清除。第二年3月中旬，水溫上升，嗜冷性的殺鮭氣單胞菌又開始大量生長繁殖。3月18日現(xiàn)場診斷時，大部分魚的體表、鰭條、口腔和消化道均潰爛；而這時水溫較低(15.5 ℃)，即使健康魚的食欲也很差，而感染魚也因為炎癥性厭食而不能攝食。因此，病魚無法攝入敏感抗菌藥物是本病治療失敗的重要原因。3月27日采樣分離鑒定細菌時，水溫已經(jīng)上升到24.5℃，達到了嗜溫性嗜水氣單胞菌生長的適應宜溫度，進一步加劇了患魚的損傷和死亡。因此，由嗜冷性的殺鮭氣單胞菌和嗜溫性的嗜水氣單胞菌在低溫期到高溫期過渡階段引起的混合感染，應該引起充分重視。筆者在病史調查中了解到，該池魚沒有拉網(wǎng)或并池。最值得懷疑的發(fā)病誘因有兩點，一是年前魚價低，養(yǎng)殖戶使用了品質不好的飼料且停食過早；其次，上一年11月份病魚患潰爛癥后，沒有徹底治療好。越冬期魚體質弱且?guī)Ь蕉赡苁潜静￠_春暴發(fā)的原因。因此，筆者建議在上一年的秋冬季節(jié)，晚停食且使用優(yōu)質飼料，第二年春季要早開食。如果上一年的秋冬季節(jié)，魚發(fā)生潰爛癥，一定要徹底治療，不為第二年開春后的疾病暴發(fā)埋下隱患。