煙葉中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)有機酸含量分析

余晶晶，王冰，蔡君蘭，郭吉兆，牛佳佳，吳晶晶，秦亞瓊，劉紹鋒，李小蘭，王宜鵬，楊松，張曉兵*

1 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001；

2 廣西中煙工業(yè)有限責任公司，廣西壯族自治區(qū)南寧 530000

煙葉中含有各種各樣的有機酸，按照揮發(fā)性可分為揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和不揮發(fā)性有機酸；按照化學結(jié)構(gòu)可分為脂肪酸和其他有機酸（包括芳香酸、羥基酸等）。煙葉中有機酸含量一般為干物重的12%～16%，具有獨特的香氣和酸性，特別是揮發(fā)性有機酸。有機酸不僅是卷煙香氣質(zhì)量和風格特征的重要組成部分，還可以改變煙氣的酸堿平衡，進而對卷煙的勁頭、刺激性和口感等方面產(chǎn)生明顯的影響作用[1-3]。

煙草中有機酸具有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)，而結(jié)合態(tài)又可再細分為鹽類結(jié)合態(tài)（煙堿鹽、金屬鹽等）和酯（糖酯、脂肪酸酯等）。文獻報道的煙葉中的有機酸提取方法主要有加速溶劑萃取法[4]、索氏提取法[5]、加熱超聲萃取法（50～60℃）[6]等，這些提取條件均較劇烈，可能會伴隨脂肪酸酯、部分脂肪酸前體物的熱裂解反應。因此，這些方法不僅提取了游離態(tài)有機酸，還包含有部分有機酸鹽類結(jié)合態(tài)和酯。另外，目前有機酸總量的研究主要集中在高級脂肪酸[7-9]，通常首先采用皂化的方法使得煙葉中高級脂肪酸游離出來，然后測定高級脂肪酸總量。例如，Ellington等[9]采用了強堿溶液對煙葉進行皂化處理，由于皂化后的溶液為水相體系，采用H2SO4-甲醇溶液進行甲酯化衍生反應，并采用GC-MS法測定煙葉中高級脂肪酸的總量。然而，由于低級脂肪酸甲酯的沸點低，且質(zhì)譜靈敏度響應較低，甲酯化衍生的方法不適合揮發(fā)性有機酸的測定[9-11]；而不同的有機酸硅烷化衍生后靈敏度均較高，因此硅烷化衍生的方法可適用于揮發(fā)性、半揮發(fā)和不揮發(fā)有機酸的分析[4-6]。另外，煙草行業(yè)已有標準方法YC/T 500-2014[12]采用了丙酮振蕩萃取煙葉樣品中的揮發(fā)性有機酸，然后選用極性色譜柱-GC-MS分析，該方法中低級脂肪酸，如甲酸、乙酸、丙酸色譜峰拖尾嚴重。

為考察煙葉中不同形態(tài)有機酸含量差異，本文分別建立了煙葉中有機酸游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)的分析方法和煙葉皂化后測定有機酸總量的分析方法。本文研究的主要為揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機酸，為簡便稱之為有機酸，但不包括多元酸等不揮發(fā)性和難揮發(fā)性有機酸。

首先采用了較溫和的提取方法—煙葉調(diào)整pH值-溶劑萃取法，使鹽類結(jié)合態(tài)的有機酸游離出來，接著采用溶劑萃取，并結(jié)合硅烷化衍生-GC-MS/MS法，實現(xiàn)了煙葉中33種有機酸（8種短鏈脂肪酸、7種中鏈脂肪酸、10種長鏈脂肪酸和8種其他有機酸）游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)總量的測定。采用皂化法將煙葉中有機酸游離態(tài)、有機酸鹽類和酯均轉(zhuǎn)化為強堿鹽，然后采用酸中和使得有機酸游離出來，結(jié)合硅烷化衍生化-GC-MS/MS技術測定不同形態(tài)有機酸的總量。采用所建立的方法對不同類型煙葉皂化前后有機酸含量的差異進行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

標準品：異丁酸、2-甲基丁酸、2-丁烯酸、戊酸、惕格酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、十七酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、十九酸、二十酸（純度均＞98.0%，加拿大TRC公司）；3-甲基戊酸、2-辛烯酸、十四酸、苯甲酸、3-苯基丙酸、2-羥基苯甲酸（純度均＞97.0%，日本TCI公司）；12-甲基十四烷酸（純度均＞98.0%，Sigma公司）、十六酸（純度均＞99.0%，阿拉丁公司）、乙酰丙酸（純度均＞98.0%，北京伊凱諾公司）、苯乙酸（純度均＞95.0%，key organics公司）；間甲基苯甲酸（純度均＞97.0%，Accela上海韶遠公司）；4-甲基戊酸、壬酸、十一酸、月桂酸、2-呋喃甲酸、肉桂酸（純度均＞98.0%，百靈威公司）。

試劑：甲醇（HPLC級，美國Fisher公司）；二氯甲烷（AR級，美國Acros Organics公司）；氫氧化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（AR級，天津科密歐試劑開發(fā)中心）；N,O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（美國Fluka公司）。實驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

儀器：氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher scientific公司，Trace 1310 GC-TSQ Quantum XLS）；CP2245電子天平（感量0.0001 g，德國Sartorius公司）；數(shù)顯型旋渦混合器（美國TALBOYS Advanced Multi-Tube Vortexer）；德國SIGMA 3-30KS離心機；pH計（瑞士Metrohm萬通，702 SM Titrino）。

樣品信息：選取代表性煙葉樣品33個進行分析，具體樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息表Tab.1 Sample information

1.2 標準溶液配制與標準曲線制作方法

實驗采用反-2-己烯酸為內(nèi)標，內(nèi)標濃度為0.5 μg/mL。分別稱取一定量有機酸標準品于10 mL容量瓶中，采用含有內(nèi)標（0.5 μg/mL反式-2-己烯酸）的二氯甲烷配制成單標母液。取一定量不同有機酸單標母液，加入10 mL容量瓶中，配制標線最高濃度混標，并通過逐級稀釋制作標準曲線。標準曲線制作過程中均采用含有內(nèi)標的二氯甲烷溶液稀釋，以內(nèi)標法定量。

1.3 樣品的前處理

采用皂化-硅烷化法，測定有機酸游離態(tài)、有機酸鹽類和酯類的總量。采用調(diào)整pH 值后萃取-硅烷化法，測定有機酸的游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)總量。

1.3.1 煙葉皂化-硅烷化法的前處理過程

取 1.0 g 煙末，精確到 0.001 g，準確加入 0.5 mol/LKOH 的甲醇溶液 50 mL，65℃水浴反應 2 h。取25 mL皂化后的溶液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干，濃縮瓶中加入1.0 mL水進行復溶，將復溶后的混合物轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，濃縮瓶中再加入1.0 mL水和1.0 mL磷酸，混合后逐滴加入上述50 mL離心管中（冰水浴），將混合物pH調(diào)整至約為2.0。加入15 mL含內(nèi)標（0.5 μg/mL反式-2-己烯酸）的二氯甲烷溶液，渦旋萃取 20 min（2500 rpm），然后離心 3 min（8000轉(zhuǎn)），靜置2 min。取1.0 mL二氯甲烷溶液，加入 200 μL BSTFA，60℃水浴衍生反應 40 min，進GC-MS/MS儀器分析。

1.3.2 煙葉調(diào)整pH值后萃取-硅烷化法的前處理方法

將 60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 90 mL 水中，再加入9.5g 85% H3PO4配成泡發(fā)液。取 2.0 g煙末，精確到0.001 g，加入 3.0 mL 泡發(fā)液后靜置 30 min。煙葉 pH值約為 2.5。然后加入 15 mL 含內(nèi)標（0.5 μg/mL 反式-2-己烯酸）的二氯甲烷溶液，進行渦旋萃取和硅烷化衍生反應，后續(xù)操作同1.3.1。

1.4 儀器條件

有機酸經(jīng)硅烷化衍生后為非極性化合物，選擇DB-5MS 石英毛細管柱（60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μm d.f.）；進樣口280℃；進樣量1 μL；分流比10:1；恒流模式，流速1 mL/min；載氣：氦氣；溶劑延遲:6 min；程序升溫為：初溫40℃保持3 min，以4℃/min升至280℃，保持20 min。離子源為電子轟擊（EI），掃描方式為全掃描和選擇離子掃描同時進行，離子源溫度為300℃，傳輸線溫度為280℃，四級桿溫度為180℃。目標物為33種有機酸，包括短鏈脂肪酸（8種）、中鏈脂肪酸（7種）、長鏈脂肪酸（10種）、其他有機酸（8種），各有機酸保留時間、碰撞能、定性定量離子見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉皂化-硅烷化測定有機酸總量分析方法的建立

為測定煙葉中有機酸的總量，采用KOH-甲醇溶液對煙葉進行皂化處理，并進行衍生化反應后采用GC-MS/MS技術進行分析，所測得的有機酸含量簡稱為皂化總量。

考察了甲酯化和硅烷化兩種衍生方法。其中，煙草行業(yè)標準方法YC/T 288-2009[13]即采用硫酸-甲醇回流進行甲酯化衍生以測定煙草及煙草制品中多元酸（草酸、蘋果酸和檸檬酸）。由于短鏈脂肪酸含量較低，且短鏈脂肪酸甲酯的質(zhì)譜靈敏度較低，采用甲酯化衍生后，色譜出峰較少，主要為長鏈脂肪酸和多元酸（乙二酸、蘋果酸、檸檬酸等），而大量的短鏈脂肪酸，如對煙葉香味有重要影響的2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸等均未檢出。然而，硅烷化衍生的方法能大大提高有機酸的質(zhì)譜靈敏度[4-6]，可滿足多種有機酸皂化總量的測定。為了實現(xiàn)煙葉皂化后溶液的硅烷化衍生反應，在皂化結(jié)束后對溶液進行濃縮，以除去甲醇，然后在冰水浴條件下采用磷酸進行中和，使得有機酸游離出來，然后采用二氯甲烷對有機酸進行萃取，最后進行硅烷化衍生分析。實驗結(jié)果表明采用皂化-硅烷化的方法可實現(xiàn)煙葉中多種有機酸總量的定性定量分析。

煙葉中葡萄糖、果膠和纖維素占煙葉干重均為7%～8%左右，為考察它們在皂化過程是否會產(chǎn)生干擾，實驗中對葡萄糖、果膠、纖維素進行了同樣的實驗，即分別取0.1 g葡萄糖、果膠、纖維素的標準品，按照1.3.1煙葉皂化-硅烷化法的前處理過程進行反應，并對反應產(chǎn)物進行了定性定量分析，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，葡萄糖、果膠和纖維素在硫酸-甲醇回流反應后均能產(chǎn)生大量的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和3-羥基丙酸?？梢?，本文中皂化-硅烷化法的前處理過程使得葡萄糖、果膠和纖維素反應產(chǎn)生了大量的有機酸。因此，皂化-硅烷化的方法不適合煙葉中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和3-羥基丙酸總量的分析。

因此，本文采用皂化-硅烷化法測定煙葉中33種有機酸（表2，包括8種短鏈脂肪酸、7種中鏈脂肪酸、10種長鏈脂肪酸、8種其他有機酸）的皂化總量，對皂化反應的產(chǎn)率和精密度進行了考察。選擇幾種典型的酯（2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、苯甲酸異戊酯、辛酸異戊酯、苯乙酸異戊酯、肉桂酸苯乙酯、十二酸甲酯、十四酸異丙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、十八酸乙酯）在低、中、高三個不同濃度水平進行加標，測定酯皂化后酸的產(chǎn)率。結(jié)果表明，所對應的酸的皂化-硅烷化衍生的產(chǎn)率在76.4%～109%之間，其中長鏈脂肪酸產(chǎn)率較高，均大于99.0%。另外，選取典型煙葉樣品，進行方法日內(nèi)及日間精密度實驗。在同一天中，對所選樣品一天內(nèi)進行5平行實驗以考察方法日內(nèi)精密度，對所選樣品連續(xù)5天進行實驗以考察方法日間精密度，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，皂化-硅烷化測定煙葉中33種有機酸總量的方法日內(nèi)、日間精密度均小于14.9%。

表2 有機酸保留時間、碰撞能、定性定量離子對Tab.2 Retention time,collison energy,qualitative and quantitative ion of organic acids

表3 葡萄糖、果膠、纖維素硫酸-甲醇回流實驗結(jié)果Tab.3 Result of H2SO4-CH3OH reflux reaction of sugar,pectin and cellulose μg/g

2.2 煙葉調(diào)整pH值后萃取-硅烷化測定有機酸分析方法的建立

由于煙葉中有機酸和有機酸鹽類結(jié)合態(tài)存在平衡狀態(tài)，為實現(xiàn)煙葉中有機酸和有機酸鹽類結(jié)合態(tài)的完全萃取，將煙葉pH值調(diào)整至酸性并進行泡發(fā)，使得有機酸鹽類結(jié)合態(tài)游離出來，然后再采用二氯甲烷萃取有機酸游離態(tài)，進行硅烷化衍生后GC-MS/MS分析，所測得的有機酸含量簡稱為萃取量。

為考察方法的準確性，對方法的回收率和精密度進行了考察。對煙葉樣品中有機酸游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)回收率分別進行了考察。結(jié)果表明33種有機酸平均回收率在88.2～110%之間。另外，以庚酸鈉、辛酸鈉、苯甲酸鈉、肉桂酸鈉、十四酸鈉、油酸鈉、硬脂酸鈉為代表，考察本方法中有機酸鹽類結(jié)合態(tài)的回收率，結(jié)果表明有機酸鹽類結(jié)合態(tài)回收率在92.6%～103%之間。因此，本方法采用對煙葉調(diào)整pH值并進行泡發(fā)后萃取，能將煙葉中有機酸游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)完全萃取出來。另外，進行方法日內(nèi)及日間精密度實驗，結(jié)果見表4，日內(nèi)、日間精密度均小于11.2%。

2.3 方法檢測限及定量限

本文分別采用煙葉皂化-硅烷化法和煙葉調(diào)整pH值后萃取-硅烷化法測定有機酸的皂化總量和萃取量。由于兩種方法前處理方法不同，儀器方法相同，因此方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）相同，對方法的檢測限和定量限進行了考察。取最低濃度標準工作溶液，采用GC-MS/MS儀器進行分析10次平行測定，計算標準偏差，以3倍標準偏差為檢測限，10倍標準偏差為定量限，結(jié)果如表4所示。其中，十六酸、十七酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸和十九酸的檢出限在10.3～140 ng/mL之間，其他有機酸檢出限均低于10 ng/mL。

表4 方法日內(nèi)日間精密度、檢測限、定量限Tab.4 Intra-day and inter-day precision,LOD,LOQ of the developed methods

續(xù)表4

2.4 典型煙葉樣品中有機酸皂化總量和萃取量測定結(jié)果

選擇一個典型烤煙煙葉樣品，采用所建立的方法測定樣品中33種有機酸的皂化總量和萃取量，結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明煙葉皂化總量顯著高于萃取量。對皂化總量與萃取量計算比值，結(jié)果見表5，二者比值反映了對應的有機酸酯含量的高低，不同的有機酸比值差異很大。其中，短鏈、中鏈、長鏈脂肪酸和其他有機酸兩種方法測得含量的比值分別在1.3～70.7倍、2.4～12.8倍、4.7～7.7倍、1.7～45.1倍之間。例如，2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸二者比值分別為70.7、20.3、10.0倍，主要是由于這些酸在煙葉中主要以糖酯的形式存在[14-16]，皂化反應使其游離出來。另外，長鏈脂肪酸如十六酸、硬脂酸、十九酸、二十酸二者比值分別為5.1、5.0、6.1、4.9倍，可見，煙葉中長鏈脂肪酸酯含量較高，在卷煙燃燒過程中會裂解產(chǎn)生相應的長鏈脂肪酸。

表5 典型烤煙煙葉樣品中有機酸皂化總量和萃取量Tab.5 Saponification and extraction amounts of organic acids in typical flue-cured tobacco leaf samples

續(xù)表5

2.5 不同類型煙葉中有機酸皂化總量和萃取量差異分析

采用所建立的煙葉皂化-硅烷化測定有機酸皂化總量和煙葉調(diào)整pH值后萃取-硅烷化測定有機酸的方法對33個不同類型煙葉樣品有機酸含量進行測定，包括29個烤煙C3F樣品，2個白肋煙樣品，1個香料煙和1個曬紅煙樣品，具體樣品信息見表1。對不同類型煙葉樣品測定結(jié)果求平均值后進行比較分析，同時由于煙葉中不同有機酸含量差異很大，為了便于比較，對測定值進行最大值歸一化作圖，結(jié)果見圖1～圖8所示。

圖1所示為不同類型煙葉樣品中短鏈脂肪酸皂化總量和萃取量的比較圖，圖2所示為不同類型煙葉短鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖。由圖1可知，不同類型煙葉樣品中短鏈脂肪酸的皂化總量均明顯高于萃取量。另外，香料煙的異丁酸、2-甲基丁酸、惕格酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、己酸的皂化總量為四種類型煙葉最高。由圖2可知，香料煙中所有短鏈脂肪酸的皂化總量與萃取量比值均為四種類型煙葉中最高。其中，香料煙中皂化總量與萃取量比值高于50倍的有4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、2-甲基丁酸、惕格酸、異丁酸，其中比值最高的為4-甲基戊酸，3-甲基戊酸、2-甲基丁酸次之。這與香料煙的糖酯含量高有關，而糖酯結(jié)合的主要為短鏈脂肪酸，如異丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸等，它們在卷煙燃燒時被裂解釋放出來，形成香料煙煙氣的主要特征香氣，對煙葉皂化處理后可將糖酯中結(jié)合的短鏈脂肪酸游離出來。

圖1 不同類型煙葉中短鏈脂肪酸的皂化總量和萃取量Fig.1 Saponification amount and extraction amount of short-chain fatty acids in different types of tobacco leaves

圖2 不同類型煙葉短鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖Fig.2 Ratio of saponification and extraction amounts of short chain fatty acids in different types of tobacco leaves

圖3 不同類型煙葉中鏈脂肪酸皂化總量和萃取量的比較圖Fig.3 Saponification and extraction amounts of medium-chain fatty acids in different type tobacco

圖4 不同類型煙葉中鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖Fig.4 Ratio of saponification and extraction amounts of medium chain fatty acids in different type tobacco leaves

圖5 不同類型煙葉長鏈脂肪酸皂化總量和萃取量的比較圖Fig.5 Saponification and extraction amounts of long chain fatty acids in different type tobacco leaves

圖6 不同類型煙葉長鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖Fig.6 Ratio of saponification and extraction amounts of long chain fatty acids in different type tobacco leaves

圖3為不同類型煙葉中鏈脂肪酸皂化總量和萃取量的比較圖，圖4所示為不同類型煙葉中鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖。由圖3可知，不同類型煙葉樣品中中鏈脂肪酸的皂化總量均明顯高于萃取量。四種類型煙葉中，曬紅煙中辛酸、2-辛烯酸、壬酸、癸酸的皂化總量最高，香料煙中庚酸和月桂酸皂化總量最高，烤煙中十一酸皂化總量最高。由圖4可知，不同類型煙葉中鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值無規(guī)律性差異，例如烤煙中庚酸、壬酸、癸酸、十一酸比值最大（高于5倍），曬紅煙中辛酸和月桂酸比值最大（高于10倍）。

圖5為不同類型煙葉長鏈脂肪酸皂化總量和萃取量的比較圖，圖6所示為不同類型煙葉長鏈脂肪酸皂化總量與萃取量的比值圖。由圖5可知，不同類型煙葉樣品中長鏈脂肪酸的皂化總量基本均高于萃取量，但白肋煙中十九酸皂化總量與萃取量相當。四種類型煙葉中，香料煙中十四酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸皂化總量最高，烤煙中十六酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸皂化總量最高，曬紅煙中十九酸皂化總量最高，白肋煙中所有長鏈脂肪酸皂化總量均為最低。由圖6可知，不同類型煙葉中，烤煙的長鏈脂肪酸（除十六酸外）皂化總量與萃取量比值最高，曬紅煙次之，香料煙和白肋煙較低。其中，烤煙的長鏈脂肪酸皂化總量與萃取量比值高于5倍的有十四酸、十六酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、十九酸。

圖7 不同類型煙葉其他有機酸皂化總量和萃取量的比較圖Fig.7 Saponification and extraction amounts of other fatty acids in different type tobacco leaves

圖8 不同類型煙葉其他有機酸皂化總量與萃取量的比值圖Fig.8 Ratio of saponification and extraction amounts of other fatty acids in different type tobacco leaves

圖7為不同類型煙葉其他有機酸皂化總量和萃取量的比較圖，圖8所示為不同類型煙葉其他有機酸皂化總量與萃取量的比值圖。由圖7可知，不同類型煙葉樣品中其他有機酸的皂化總量基本均高于萃取量。四種類型煙葉中，香料煙中2-呋喃甲酸、間甲基苯甲酸、3-苯基丙酸、2-羥基苯甲酸、肉桂酸皂化總量最高，烤煙中乙酰丙酸皂化總量最高，白肋煙中苯甲酸、苯乙酸皂化總量最高。由圖8可知，不同類型煙葉中，烤煙其他有機酸的皂化總量與萃取量比值基本最高，其中比值高于10倍的有乙酰丙酸和肉桂酸。

綜上所述，四種類型煙葉中，香料煙中短鏈脂肪酸酯（主要為糖酯）含量最高，烤煙中長鏈脂肪酸酯和其他有機酸酯含量最高。

3 結(jié)論

本文建立了基于硅烷化-GC-MS/MS法的煙葉中有機酸的皂化總量和萃取量的分析方法，能定性定量分析煙葉中33種有機酸，包括8種短鏈脂肪酸、7種中鏈脂肪酸、10種長鏈脂肪酸、8種其他有機酸。煙葉皂化-硅烷化-GC-MS/MS法中酯的回收率在76.4～109%之間，其中長鏈脂肪酸酯回收率均大于99.0%，方法日內(nèi)、日間精密度均小于14.9%。在煙葉中加入有機酸和有機酸鹽標樣來考察煙葉調(diào)整pH值后萃取-硅烷化-GC-MS/MS法的回收率分別在88.2～110%和92.6～103%之間，表明本方法能將煙葉中有機酸游離態(tài)和鹽類結(jié)合態(tài)萃取完全；方法的日內(nèi)及日間精密度均小于11.2%。方法的檢出限較低，其中，十六酸、十七酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸和十九酸的檢出限在10.3～140 ng/mL之間，其他有機酸檢出限均低于10 ng/mL。

煙葉樣品測定結(jié)果表明煙葉皂化總量顯著高于萃取量，且不同的有機酸皂化總量與萃取量比值差異很大，其中2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸皂化總量為萃取量的10倍以上，主要是由于這些酸在煙葉中主要以糖酯的形式存在。另外，四種類型煙葉中，香料煙的短鏈脂肪酸，如異丁酸、2-甲基丁酸、惕格酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、己酸的皂化總量為四種類型煙葉最高；烤煙中長鏈脂肪酸和其他有機酸，如十六酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、乙酰丙酸皂化總量最高。