不同光照條件下外源鈣對“煙株-土壤”系統中光合碳分配的影響

云菲，宋晶，郭二輝，任天寶，王輝，姬小明，張學偉，楊喜田，劉國順

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州市金水區文化路95號 450002；

2 河南農業大學林學院 ，鄭州市金水區文化路95號 450002；

3 河南省煙草公司洛陽市公司，河南省洛陽市開元大道246號，471300；

4 廣東中煙工業有限責任公司，廣東省廣州市林和西橫路186號，510210

煙草作為喜光作物的代表，在苗期和大田期經常遭遇低光寡照或高溫強光的危害，直接導致光合同化產物的合成、積累及分配受限，最終造成產量和質量下降[1]。鈣作為煙草生長所必需的營養元素之一，參與許多環境脅迫的響應調節過程并能有效改善煙株的光合性能[2-3]。強光脅迫下，噴施外源CaCl2可提高煙株的碳同化速率，減輕光抑制，有效保護光合器官免于強光的傷害[4]。高溫脅迫下，CaCl2能使煙草維持較高的光合能力，提高其耐熱性[5]。低溫高光鍛煉過程中，CaCl2可減輕烤煙幼苗光合作用的下調[6]。CaCl2能通過調節氣孔開閉及保護PSⅡ與PSⅠ的活性，有效提高亞高溫下番茄葉片光合性能[7]。

光合碳（即光合同化固定的碳）是聯系“大氣-植物-土壤”系統碳循環的關鍵因子，光合碳在各器官中分配比例的變化將影響植株生長并改變根系碳周轉及微生物群落結構組成等[8]。水稻分蘗期光合碳有30%用于根系建成并有10%通過根系分泌物進入土壤碳庫[9]。玉米拔節期通過根際沉積將光合碳轉化為土壤有機碳的數量最大，達到 1.73 g·株-1[10]。冬小麥固定的13C輸入到地下部的總碳量為1.72 t·hm-2，成為土壤有機碳的一部分[11]。

目前，外源鈣對不同光照條件下煙株光合碳同化產物分配及其固碳效率的調控作用尚不清楚，尤其是煙草光合碳在地下部的周轉情況及其對土壤有機碳的貢獻量還有待進一步研究。因此，本研究利用13C穩定性同位素脈沖標記技術，探討光照與外源鈣共同作用下光合碳在“煙株-土壤”系統中的分配規律及循環過程，以期通過化學調控的方式提高煙草在不同光環境中的固碳能力，旨在為不同植煙區制定應變栽培技術體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與供試材料

本試驗在河南農業大學許昌校區（34°01′N，113°49′E）人工氣候室內進行。供試土壤采自許昌縣，砂壤土，有機質 12.0 g·kg-1，堿解氮 48.9 mg·kg-1，速效磷 10.8 mg·kg-1，速效鉀 140.3 mg·kg-1，pH 7.6。按120 cm×50 cm的行株距進行盆栽并置于壟上，盆高27 cm，盆口直徑33 cm，盆底直徑21 cm。土壤經風干消毒后過0.5 mm×1 mm網篩，每盆裝土20 kg。純氮的施用量控制在 3.0 g.pot-1，氮磷鉀比例為 1 : 1.5 : 3，每盆添加硝酸銨（NH4NO3）8.5 g，硫酸鉀（K2SO4）11.1 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）8.6 g，其中磷肥在移栽前全部施入，氮肥和鉀肥的70%作為基肥一次性施入，其余30%于移栽后30 d根據煙株長勢追施。以豫中地區烤煙主栽品種K326為供試材料，于2017年5月12日進行移栽，移栽后30 d，每處理選取32株生長一致的煙草進行外源鈣噴施（另選取32株噴施蒸餾水作為對照），連續噴施4 d后，第5 d將噴鈣與未噴鈣的煙株同時轉至人工氣候室接受不同光強照射，光照處理10 d后，利用13C-CO2穩定性同位素標記裝置（見 圖1）進行脈沖標記，同位素標記結束后 1 d、7 d、15 d、30 d 分 4 次取樣。具體試驗設置如下：

表1 試驗設計方案Tab.1 The set-up of test design

1.2 測定指標與方法

1.2.113C-CO2脈沖標記

參考Ge[8]、Lu[12]等人的方法，標記平臺由12CO2吸收單元（包括：4 個裝有 250 mL、1 mol·L-1NaOH的燒杯）、13CO2生成單元（包括：2個裝有10 g、豐度為98%的Ba13CO3的燒杯，2個裝有250 mL、2 mol·L-1HCl溶液的燒杯，特制塑料軟管）、12CO2生成單元（包括：2個裝有10 g豐度為98%的 Ba12CO3的燒杯、2個裝有250 mL、2 mol·L-1HCl溶液的燒杯），蠕動泵（將位于全密封標記箱內的裝有Ba13CO3的燒杯通過特制的塑料軟管與位于標記箱外部的裝有 250 mL、2 mol·L-1HCl溶液的燒杯連接起來）組成。光照處理10 d后，每處理選取4株煙草進行13C穩定性同位素脈沖標記試驗（另選4株作為對照：不標記）。標記時間持續6 h（9:00-15:00）。標記前先用1 mol·L-1NaOH吸收標記室內的12CO2（2NaOH+CO2→Na2CO3+H2O），以提高13CO2的吸收同化率。將待測煙株放入標記室內，用塑料布罩住盆中裸露在空氣中的土壤，避免呼吸產生的13CO2被重新吸收，同時放入2個裝有Ba13CO3的燒杯和 2個裝有 Ba12CO3的燒杯，在標記平臺上放置冰袋以防止標記箱內溫度過高，開動風機后關閉標記箱。標記時用黑布罩住整個標記箱，開啟蠕動泵，向其中一個裝有 Ba13CO3的燒杯中注入 2 mol·L-1HCL 溶液250 mL（Ba13CO3+2HCl→ BaCL2+H2O+13CO2），耗時10 min，待反應5 min后將黑布打開，標記開始。45 min后，重復上述步驟，向另一個裝有Ba13CO3的燒杯中注入1次HCL，以維持CO2濃度，最后 2次向 Ba12CO3的 燒杯中注入 2 mol·L-1HCL 溶液產生12CO2，以達到最佳標記效果。標記結束后，將煙株置于通風處以防地上部呼吸產生的13CO2被重新吸收。

圖1 煙草13C-CO2同位素標記裝置及人工氣候室試驗設置示意圖Fig 1.Schematic diagram of tobacco 13C-CO2 isotope labeling measurement equipmen and the artificial climate chamber

1.2.2 樣品制備與計算

將每處理32株煙草進行一次性13C-CO2脈沖標記，標記結束后 1 d、7 d、15 d、30 d 分 4 次對標記與未標記的煙株及土壤進行破壞性取樣，每次選取4株經13C脈沖標記過的煙草和4株未標記的煙草，從基部砍斷煙草植株，將根、莖、葉用去離子水沖洗瀝干后放入烘箱，105℃殺青15 min， 65℃恒溫烘干至恒重，粉碎后過0.25 mm篩用于測定煙株13C豐度，并計算各組分生物量。將土壤樣品混合均勻后，平鋪于塑料布上風干，過0.85 mm篩，挑出根系及有機殘體，從煙株根系上沖下來的土壤用紗網過濾，冷凍干燥24 h后研磨，然后用四分法取約50 g土樣進一步磨細過0.25 mm篩，備測。采用質譜儀（Flash-2000 Delta V ADVADTAGE，美國）對上述煙草和土壤樣品中13C穩定性同位素比值（δ13C）進行測定；采用CNS元素分析儀（vario MACRO cube，德國）測定全碳及土壤有機碳含量。按照Lu[12]、Bolan[13]等的方法計算各組分中13C濃度、13C分配率、13C-SOC根際沉積效率及更新率。

1.3 數據統計與分析

采用 Sigmaplot 12.5 及 Microsoft Excel 2010 進行繪圖，采用R 3.3.1軟件進行相關性分析，采用SPSS 19.0對數據進行多因素方差分析，多重比較差異采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 不同光照強度下外源鈣對“煙株-土壤”系統中13C濃度的影響

由表2可知，葉片中13C濃度隨種植時間的延長呈逐漸降低趨勢，標記后30 d，各處理煙葉中13C濃度比第1 d時降低了72.4%～75.1%；標記后1～15 d，噴鈣處理葉片中13C濃度較未噴鈣處理顯著增加（P＜0.01，表3），以標記后15 d增加比例最大，不同光強間分別比未噴鈣處理增加了24.1%（低光）、10.1%（中光）和29.5%（高光），表明外源鈣在低光或高光條件下對煙葉13C濃度增加的促進效果更顯著，緩解了光脅迫對煙株生長造成的不利影響。此外，光強與外源鈣的互作效應對葉片中13C濃度的影響達到了顯著水平（P=0.03*，表3）。與葉片中13C濃度變化相反，根系中13C濃度則隨種植時間延長而升高，標記后30 d比第1 d增加了30.3%～105.3%，說明源器官通過光合作用積累的13C不斷向地下部流動用于根系生長。根系對鈣鹽的響應隨光強變化差異顯著（P＜0.01，表3），整個測定期內，在低光和高光條件下施鈣處理根系的13C濃度分別比對照增加了0.3%～40.6%和1.0%～30.1%，而在中光條件下并未比對照增加。土體中13C濃度僅為：0.0214～0.0637 mg·g-1，施用外源鈣后土體中13C濃度比未噴鈣處理增加了0.5%～49.3%，且以低光條件下增加比例最大。

表2 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C濃度的影響Tab.2 Effect of exogenous calcium application on concentration of photosynthesized 13C in tobacco-soil system under different light intensity

2.2 不同光照強度下外源鈣對“煙株-土壤”系統中13C分配的影響

如圖2所示，“煙株-土壤”系統中13C的分配比例表現為：地上部（葉和莖）＞根＞土體，表明光合固定的13C大部分留在了地上部，但隨著種植時間的延長，源器官又將光合固定的新碳重新分配給地下部根系和土體。脈沖標記1 d時，葉片中13C分配率最高，達到78.2%～80.5%，隨后持續下降，到30 d時降至最低；標記后30 d，地下部根系和土體的13C分配比例分別達到27.6%～40.0%和3.8%～4.8%，比標記第1 d時分別增加了1.7～2.6 倍和1.0～2.1倍，說明光合13C隨著煙株的生長逐漸向地下部轉移。施用外源鈣顯著影響了各組分的13C分配比例（P＜0.01，表3），整個測定期內，施鈣處理地上部的13C分配率較不施鈣處理增加了0.8%～25.8%，土體中13C分配率則增加了1.0%～43.1%。光強與外源鈣的互作效應對根系中13C分配的影響達到了極顯著水平（P＜0.01，表3），根系中只有在強光條件下鈣鹽處理的13C分配比例較高，低光條件下，施鈣處理根系中的13C分配率降低，而葉片中的13C分配率增加，以保證煙株對光資源的最優化利用。

圖2 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C分配的影響Fig.2 Effect of exogenous calcium application on the distribution of photosynthesized 13C in tobacco-soil system under different light intensity

表3 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C濃度及13C分配率的影響(P值)Tab.3 Effect of exogenous calcium application on the concentration and the distribution of photosynthesized 13C in tobacco-soil system under different light intensity (P value)

2.3 不同光照強度下外源鈣對“煙株-土壤”系統中13C-SOC根際沉積效率的影響

隨測定時間推進，煙株根際沉積效率呈增加趨勢，標記后30 d達到最高，比第1 d時增加了1.3～1.9倍，這與葉片中的13C分配持續下降，光合同化的碳向地下部運輸，土體中13C分配增加相對應。土體中的13C分配率與根際沉積效率呈顯著正相關關系r=0.94（低光））、r=0.89（中光）、r=0.96（高光）（圖4）。不同光強間，以高光條件下煙株的根際沉積效率最高，測定期內分別比低光和中光條件下增加了11.3%～42.4%、5.0%～36.6%。高光環境中煙株減少了向葉片分配的13C比例，將更多的光合碳分配給根系，根系中13C分配率與根際沉積效率呈顯著正相關關系r=0.90（圖4-C）。此外，噴鈣處理的根際沉積效率在整個測定期內均高于對照，分別比對照增加了5.4%～20.1%（低光）、3.5%～34.5%（中光）、5.6%～29.0%（高光），表明外源鈣能夠加速土壤有機碳的周轉速率。光照、外源鈣對根際沉積效率的影響顯著，但二者的互作效應對其影響并不顯著（表4）。

圖3 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C-SOC根際沉積效率的影響Fig.3 Effect of exogenous calcium application on the rhizodeposition efficiency of photosynthesized 13C-SOC in tobacco-soil system under different light intensity

圖4 不同處理煙株各組分13C濃度、13C分配率與13C-SOC根際沉積效率及更新率間的相關性Fig.4 Correlation analysis among the concentration of photosynthesized 13C,the distribution of photosynthesized 13C,the rhizodeposition efficiency of photosynthesized 13C-SOC and the renewal rate in tobacco-soil system under different light intensity

2.4 不同光照強度下外源鈣對“煙株-土壤”系統中13C-SOC更新率的影響

由圖5可知，煙株13C-SOC更新率呈先增加后下降的趨勢，標記后15d13C-SOC更新率達到最高值，比標記第1 d增加了22.1%～70.8%，標記后30 d，各處理更新率維持在0.2%～0.4%之間，后期更新率呈下降趨勢，可能是微生物對根源碳化合物的利用引起的。經CaCl2處理的煙株13C-SOC更新率顯著升高，以標記后第1 d增加比例最高，不同光強下分別比未噴鈣處理增加了44.5%（低光）、34.9%（中光）、10.6%（高光）。光強對13C-SOC更新率的影響達到了極顯著水平（P＜0.01，表4），不同光照條件下，煙株根際沉積對土壤SOC更新率的貢獻大小表現為：高光（L3）＞中光（L2）＞低光（L1），說明增加光照能夠促進地上部與根系間碳的周轉，光合碳最終以根際沉積的形式輸入到土體中。土體中的13C濃度與13C-SOC更新率呈顯著相關性r=0.99 （低光）、r=0.99（中光）、r=0.93（高光）（圖4），由此推斷，光合碳進入地下部后，在根際微生物的作用下進行代謝周轉，并轉化為有機碳，進而促進了土壤碳固持。

圖5 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C-SOC更新率的影響Fig.5 Effect of exogenous calcium application on the renewal rate of photosynthesized 13C in tobacco-soil system under different light intensity

表4 外源鈣對不同光照強度下“煙株-土壤”系統中13C-SOC根際沉積效率、更新率及各組分生物量的影響(P值)Tab.4 Effect of exogenous calcium application on the rhizodeposition efficiency of photosynthesized 13C-SOC and the renewal rate in tobacco-soil system under different light intensity (P value)

2.5 不同光照強度下外源鈣對煙草生物量積累的影響

煙株總生物量與各部分干物質積累量隨生育期延長逐漸增加，脈沖標記后30 d各處理總生物量比第1 d時增加了1.9～9.0倍。噴施外源鈣有利于煙株生物量的增加，與未噴鈣處理比較，噴鈣處理煙株的總生物量在標記后第1 d增加比例最高，低光和高光環境中增加比例分別達到126.9%和79.4%大于中光處理的增加比例23.8%，隨種植時間延長增加比例隨之下降；說明在光脅迫條件下煙株生物量的積累對外源CaCl2的響應更敏感，噴施外源鈣彌補了光強過低或過高所造成的產量損失。不同光強間以高光條件下各部分干物質積累最多，中光次之；高光條件下，噴鈣與未噴鈣處理的總生物量分別比中光條件下增加了42.8%～146.8%和17.3～70.2%；可見，噴鈣處理生物量增加的比例較對照高。高光條件下噴鈣處理的煙株葉、莖、根各組分生物量分別比對照增加了：11.5%～116.8%、2.6%～276.2%和7.0%～138.1%。光強、外源鈣以及二者的互作效應對葉、莖、根生物量積累的影響達到了極顯著水平（P＜0.01，表4）。

圖6 外源鈣對不同光照強度下煙株生物量積累的影響Fig.6 Effect of exogenous calcium application on the biomass accumulation of tobacco under different light intensity

3 討論

3.1 外源鈣對不同光照條件下“煙株-土壤”系統中光合碳分配的影響

碳素在植株冠部與根部的分配是“植物-土壤”系統潛在碳固定能力的指示[14]。在“煙株-土壤”系統各組分中，以葉片中的13C分配比例最高，說明光合固定的13C大部分留在了煙株的收獲器官中，有利于其產量形成。隨種植時間延長，葉片中的13C分配比例持續下降而根系以及土體中的13C分配率則逐漸增高，這表明葉片通過光合作用所固定的碳在煙株體內不斷向地下部轉移用于根系生長，并以根際沉積物等形式輸入到土體。煙株源器官(葉片)中的13C濃度與13C分配下降，一方面與煙株生物量不斷增加所產生的“稀釋效應”有關，即未標記的部分同化13C稀釋了已固定的13C；另一方面，是由于煙株與土壤呼吸損失掉一部分13C[15]。光強變化后，植物通過改變光合產物的分配來調節體內碳氮平衡[16]。弱光條件下根系中13C濃度最低，這是由于光強減弱后，煙株為了在有限的光資源下捕獲更多的光能進行光合作用，增加了光合產物向葉片中的分配，而減少了根系中13C的分配比例；另外，煙株在弱光環境中氮代謝強度大于碳代謝，淀粉含量降低，而淀粉含量與光合產物向地下部的分配比例呈正比，導致光合產物向地下部根系的分配比例降低[17]。維持植物體內一定濃度的鈣水平對光保護機制具有重要作用[18]。經CaCl2處理后，葉片與根系的13C濃度在低光和高光脅迫環境中增加比例較高，土體中13C濃度在低光下增加比例最大，這與外源鈣能夠提高光脅迫條件下煙株的光化學反應效率，減輕光抑制，最終增強了對碳素的吸收轉化有關[19]，說明煙株在遭受光脅迫時對外源鈣的響應更強烈，并通過增加光合碳的含量來促進光合作用。

3.2 外源鈣對不同光照條件下“煙株-土壤”系統中土壤碳積累的影響

根際沉積（rhizodeposition）是光合碳向地下部輸入的重要環節，大部分土壤有機碳直接來源于光合碳的輸入與轉化，光合碳最終以根系分泌物與根際沉積物等形式進入土壤碳庫[20]。因受植物類型、標記時間、測定方法及管理方式等因素的綜合影響，地下部光合碳的分配存在很大差異，大約有30%～60%的光合碳輸入到根部，其中的4%～70%釋放進根際，除去土壤呼吸消耗，僅有2%～5%被轉化為穩定的土壤有機碳[21-22]。通過根際沉積作用將光合同化碳轉化為土壤有機碳的效率即為根際沉積效率（用土壤13C-SOC與13C-煙株含碳量的比率表示）[23]。土壤有機碳來源于煙株根際沉積的部分占有機碳總量的比例即為13C-SOC的更新率[24]。本研究中，13C-SOC根際沉積效率隨著煙株的生長呈逐漸增加趨勢，根系與土體中的13C分配率與根際沉積效率呈極顯著相關，說明一部分由源器官合成的光合碳以根際沉積的形式轉移至土體當中，根際沉積碳在微生物的作用下進行代謝周轉，最終與土壤礦物作用形成穩定的土壤有機質，進而促進了土壤碳轉化和有機碳的積累[25]。強光條件下煙株的根際沉積率與更新率最高，一方面與強光下煙株固定的光合碳含量高有關；另一方面是由于高光強下煙株改變了光合碳的分配格局，增加了光合產物向根系的分配比例，使得土壤碳庫中的碳截存增加，促進了土壤有機碳的積累。此外，鈣能夠促進根系分泌物與微生物群落的結合，使得根際微生物代謝活躍，加速13C在土壤中的吸收與周轉[26,32]。煙株噴施外源鈣后能否對微生物量碳及根系分泌物有影響，有待后續試驗進一步證實。因此，今后仍需深入研究如何通過地上部化學調控，優化根冠之間的碳分配與碳平衡，在促進煙株生長的同時減少無謂消耗，降低碳損失，促進煙田土壤的碳平衡。

3.3 外源鈣對不同光照條件下煙株生物量積累的影響

植物光合作用形成的有機化合物約占干物質重的90%，碳是構成有機化合物的骨架，約占有機化合物的40%～50%[27]。本試驗中，煙株生物量隨光強升高而增加，與Wang等[28]的研究結果一致。不同光照條件下煙株的生物量分配總體呈現為：葉＞莖＞根，與13C在煙株各組分中的分配格局相對應。在弱光條件下，煙株根系的生物量減少，促使光合產物最大限度地用于地上部光合機構的建成以保證光合碳同化的正常進行；而在強光條件下，煙株則通過地下部生物量的積累形成發達的根系，有利于其從土壤中吸收水分和礦物質以維持地上部較高的光合速率和蒸騰作用，使煙株最大限度地利用環境中的光熱資源，其對光環境變化所采取的響應策略與其他作物類似[29-31]。同一光照強度下，施入外源鈣后煙株葉、莖、根以及總生物量均呈增加趨勢，且在標記后第1 d增加比例最大，隨后下降。弱光條件下煙株總生物量較中光下降低，但經CaCl2處理后其降低的比例比未噴鈣處理減少了4.5%～101.6%，說明外源鈣促進了煙株生物量的增加，這一方面是由于施鈣提高了煙株的光化學反應效率，光合碳同化能力增強[4,21]；另一方面可能與外源鈣能加速植物對氮素的吸收代謝，促進氨基酸和蛋白質合成，進而改變了煙株同化產物的分配格局有關[32]。

4 結論

（1）光合碳在“煙株-土壤”系統中，主要集中在地上部，并隨著生育期的延長，逐漸向地下部和土壤中轉運，光強增加有利于光合碳的積累及生物量增加。

（2）外源鈣可促進煙株光合碳同化能力提高，促進光合碳在煙株體內的積累，加速土壤中新碳的轉化，增加根際沉積率，有利于光合碳在土壤中的固持。