有機肥長期定位施用對煙田土壤養分和煙株根際土壤細菌群落的影響

蔣雨洲，陳順輝，李文卿*，劉青麗，李志宏，張云貴

1 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；

2 福建省煙草專賣局煙草科學研究所，福州 350013

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在有機質分解、營養循環、植物生長的促進或抑制等方面均發揮著重要的作用[1]。施肥年限、施肥類型和土壤本質等因素，都會對土壤微生物活性、基因表達、生物量和群落結構產生不同影響，最終表現為對農田有害、有益和無影響的結果[2]。因此，研究施肥對農田土壤微生物群落的影響有著重要意義。

施肥作為最為廣泛的管理方式，可改變土壤養分狀況和土壤微生物群落結構，從而影響土壤質量、生物肥力、生產力以及農田生態系統的穩定性[3-4]。土壤養分與微生物處于動態的相互作用中：一方面，土壤養分作用于微生物影響土壤微生物種群關系[5-6]。吳迪等[7]研究認為，施肥會提高根際土壤細菌、真菌和放線菌數量；Xun等[8]研究發現長期施用有機肥或有機無機配施能夠維持土壤細菌的多樣性，而長期施用無機肥能夠顯著降低土壤細菌多樣性；Lovell等[9]研究認為，長期施用無機氮肥會降低土壤微生物活性。另一方面，微生物也能作用于土壤養分[10-11]，微生物量在養分循環及釋放方面具有重要地位，能直接反映土壤的肥力狀況[12]。呂衛光等[13]通過盆栽和田間研究表明，長期黃瓜連作使土壤微生物群落結構發生改變，造成土壤養分不平衡，促使土壤磷過剩，鉀消耗過多。目前，有關化學肥料對土壤微生物量和微生物群落結構和功能多樣性的影響較為復雜，研究結果不盡一致。土壤微生物對化肥的反應，依賴于養分是否抑制微生物的生長和活性[14]，不當施用化肥不利于改善土壤整體的生物性質[15]。

稻草還田和餅肥施用是南方煙－稻輪作體系下重要的煙田有機質補充措施。賈海江[16]研究表明，覆蓋還田和翻壓還田能夠提高烤煙干物質積累量和質量。黃平娜等[17]通過3年連續田間試驗表明，稻草還田不僅能提高煙葉產量，還有利于提高烤煙的產值，促使上、中等煙葉比例達到90%。有研究指出餅肥配施對烤煙煙葉品質形成具有重要作用[18-19]。韓錦峰[20]研究結果表明餅肥氮和化肥氮各占50%的配比效果最好。張煥菊[21]研究證明30%有機肥+70%復合肥時為佳,其他減肥比例會對烤煙生產帶來不同程度的不良影響。已有研究主要針對當季稻草還田或餅肥施用對烤煙生產的影響研究，而關于8年的長期定位施肥條件下稻草還田或餅肥施用對煙田土壤細菌群落結構和豐度的影響尚未見報道。本文主要探討長期定位稻草還田和餅肥施用對煙田土壤細菌群落的影響，旨在為煙田施肥和耕作制度優化，提高土壤可持續生產力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和品種

試驗在福州市晉安區宦溪鎮福建省煙草科學研究所科研基地進行，2009年開始進行定位施肥處理。2008年水稻收割后試驗田0～20 cm耕層土壤基本養分含量分別為：有機質28.96 g/kg，堿解氮144.66 mg/kg，速效磷 5.85 mg/kg，速效鉀 142.43 mg/kg，pH 5.76。土壤類型為沙壤土。微生物取樣于2017年6月15日進行。供試烤煙品種為翠碧1號。

1.2 試驗設計與管理

從2009年烤煙生產季開始，將田塊分成3個小區，每個小區350 m2，分別設置3個處理，不設重復。T1：常規施用化肥對照處理，每年水稻收割后所有稻稈清除出田；T2：常規施用化肥+稻草回田處理，在T1處理施肥的基礎上，水稻收割后所有稻稈粉碎回田處理；T3：常規施用化肥+稻草回田+餅肥處理，在T2處理的基礎上移栽前施條溝肥時增加施用餅肥300 kg/hm2。各處理每年晚稻收割后均進行溶田。每個處理2009—2013年烤煙生產季施用90 kg/hm2。化肥 氮，N：P2O5：K2O ＝ 1：0.75：2.63；2014-2017年烤煙生產季施用97.5 kg/hm2化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；（肥料分別為煙草專用肥N：P2O5：K2O＝12：8：22，復合肥N：P2O5：K2O＝15：15：15；硝酸鉀N：P2O5：K2O＝13：0：38和硫酸鉀含K2O 51%）；基肥：追肥=60：40。2017年度餅肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g/kg，全鉀含量11.92 g/kg。每年水稻季施用96.3 kg/hm2氮肥，70.5 kg/hm2的 P2O5和 26.25 kg/hm2的 K2O， 肥 料種類分別為碳銨、過鈣（有效磷≥12%）、復合肥（N：P2O5：K2O＝15：15：15）和水稻專用肥（N：P2O5：K2O ＝ 12：6：7）。

1.3 樣品采集

1.3.1 土壤理化性質測定樣品采集

在2017年烤煙施肥移栽前，各小區按梅花5點取0～20 cm耕層土壤混合樣，剔除雜質后，并過5 mm篩，風干待測定土壤常規理化性質。6月30日煙葉采收結束后每處理距離煙株15 cm處取3個煙畦縱切面土壤（2 cm厚度）混合樣，風干后測定其化學成分。

1.3.2 土壤細菌多樣性測定樣品采集

在2017年6月15日，烤煙收獲季取植煙根際土壤，每個處理小區各取樣3次重復，剔除雜質后并過2 mm篩，裝于封口袋冷凍保存，進行功能基因多樣性分析。

1.4 樣品的測定

土壤理化性質測定采用常規分析的方法。有機質采用硫酸-重鉻酸鉀法，pH采用電位法，全氮采用半微量凱氏法，全磷采用氫氟酸-高氯酸消化法-鉬藍比色法，全鉀采用氫氟酸-高氯酸消化-火焰光度法，堿解氮采用擴散皿法，速效磷采用磷碳酸氫鈉法或鹽酸-氟化銨法，速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度法，陽離子交換量（CEC）采用1 mol/L乙酸銨交換法。

土壤樣品由北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序，準確稱取0.25 g土壤樣品，使用MOBIO公司的試劑盒（PowerSoil?DNA Isolation Kit）提取土壤DNA。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物采用Caliper LabChip儀器，用熒光定量試劑HT DNA 1K Reagent Kit，PerkinElme進行檢測定量。獲得純化的DNA后對細菌的16SrRNA基因V3～V4區通過Illumina平臺的MiSeq進行高通量測序，測序試劑盒為Miseq?Reagent Kit v3（600 cycle）（PE 300）；引物為336F/808R（GTACTCCTACGGAGGCAGCA，GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

1.5 計算方法和數據分析

Miseq測序得到雙端序列數據，根據不同測序數據類型選用不同的參考數據庫用usearch軟件去除嵌合體，通過mothur去掉長度較小的tags。對優化序列提取非重復序列，去除沒有重復的單序列。采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。所用軟件為：Trimmomatic、FLASH、Pear、usearch。

試驗數據經EXCEL 2010整理后作圖，并用SPSS 11.5軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 有機肥長期定位施用對土壤化學性質的影響

由表1可見，經過連續8年的定位施肥，3個處理水稻收割后土壤有機質和pH值均較明顯下降；堿解氮、速效磷含量和T1（常規施用化肥）對照處理的速效鉀含量均明顯上升。與T1處理相比，T2（化肥+稻草回田）和T3（化肥+稻草回田+餅肥）處理對有機質、堿解氮和速效鉀有著影響，但使pH值明顯下降， T2處理速效磷含量下降，T3處理速效磷含量上升。說明在稻草還田基礎上并添加餅肥后，能夠改善煙田土壤化學性質綜合指標，而單獨采用稻草還田，更有利于改善烤煙土壤化學性質綜合指標。

表1 不同施肥處理田煙土壤化學性質的影響Tab.1 Chemical properties of flue-cured tobacco soil under different fertilizer treatments

2.2 有機肥長期定位施用對煙田土壤微生物α多樣性的影響

如圖1所示，與長期單一施化肥的T1處理相比，稻草還田T2處理能夠提高煙田土壤中chao1指數，而再增加餅肥的T3處理則降低煙田土壤中chao1指數，但3個處理間無顯著性差異。說明，在試驗時間范圍內不同處理對土壤細菌α多樣性影響較小。

圖1 不同施肥處理煙田土壤中細菌α多樣性chao1指數分析Fig.1 α-diversity chao1 index of microorganisms in tobacco field soil treated with different fertilizers

2.3 有機肥長期定位施用對煙田土壤中微生物群落結構的影響

如圖2可知，3個處理共測得1871個OTU。T1和T2處理的共有OTU個數最多，為63個；而T1和T3處理的共有OTU個數與T2和T3處理相等，均為58個。T1處理獨有OTU個數最少，為11個；而T2和T3處理的獨有OTU個數相等，均為13個。說明煙-稻輪作體系下，長期稻草回田或長期稻草回田后加施餅肥均對煙田獨有細菌種類的影響較小。

圖2 不同施肥處理煙田土壤中微生物OTU數的Venn圖Fig.2 Venn of microbial OTUs in tobacco field soil treated by different fertilizers

2.4 有機肥長期定位施用對煙田土壤中微生物組成的影響

試驗的3個處理共鑒定出12個門、19個綱、33個目、51個科、63個屬。從表2可見，細菌所占比例較高（相對豐度＞5%）的主要4個菌門，依次分別為Proteobacteria＞Acidobacteria＞Chloroflexi＞ Actinobacteria，分別介于29.82%～33.41%、15.34%～19.61%、13.26%～13.47% 和 11.56%～13.10%之間。T1處理Proteobacteria的相對豐度為29.82%，T2和T3處理分別比T1處理增加了6.80%和12.02%；T1處理Acidobacteria的相對豐度為19.61%，T2和T3處理分別比T1處理減少了9.57%和21.79%；Chloroflexi的相對豐度T1處理為13.26%，T2處理比T1處理增加了1.56%，T3處理比T1處理減少了0.26%；Actinobacteria的相對豐度T1處理為11.56%，T2和T3處理分別比T1處理增加了5.73%和13.36%。

細菌所占比例較高（相對豐度＞5%）的主要5個菌綱，依次分別為Acidobacteria＞Alphaproteobacteria＞Actinobacteria ＞Gammaproteobacteria ＞Ktedonobacteria，分別介于14.45%～18.96%、15.57%～16.06%、7.66%～9.48%、5.90%～9.92%和6.18%～6.55%之間，Acidobacteria的相對豐度T1處理為18.96%，T2和T3處理分別比T1處理減少了11.01%和23.79%；Alphaproteobacteria的相對豐度T1處理為16.06%，T2和T3處理分別比T1處理減少了0.89%和3.06%；Actinobacteria的相對豐度T1處理為7.66%，T2和T3處理分別比T1處理增加了7.83%和23.88%；Gammaproteobacteria的相對豐度T1處理為5.90%，T2和T3處理分別比T1處理增加了34.43%和68.30%；Ktedonobacteria的相對豐度T1處理為6.18%，T2和T3處理分別比T1處理增加了6.05%和3.93%。

細菌所占比例較高（相對豐度＞5%）的主要3個菌目，依次分別為Rhizobiales＞Acidobacteriales＞Xa nthomonadales，分別介于9.30%～9.67、7.49%～9.80%和5.44%～9.52%之間。Rhizobiales的相對豐度T1處理為9.67%，T2和T3處理分別比T1處理減少了3.81%和1.04%；Acidobacteriales的相對豐度T1處理為9.80%，T2和T3處理分別比T1處理減少了6.77%和23.61%；Xanthomonadales的相對豐度T1處理為5.44%，T2和T3處理分別比T1處理增加了38.30%和74.86%。

細菌所占比例較高（相對豐度＞5%）的主要3個菌科，依次分別為Acidobacteriaceae_Subgroup_1＞Unknown_Family＞ Xanthomonadaceae，分別介于7.49%～9.80、4.98%～6.43%和3.33%～6.97%之間。科水平的細菌豐度在1%以上的有12個，分別為Xanthomonadaceae、Gemmatimonadaceae、Rhizobiales（Incertae_Sedis）、Anaerolineaceae、Planctomycetaceae、Bradyrhizobiaceae、Xanthobacteraceae、Chitinophagaceae、Acidothermaceae、Sphingomonadaceae、Xanthomonadales（Incertae_Sedis）和Acetobacteraceae。Acidobacteriaceae_Subgroup_1的相對豐度T1處理為9.80%，T2和T3處理分別比T1處理減少了6.77%和23.61%。Unknown_Family的相對豐度T1處理為6.43%，T2和T3處理分別比T1處理減少了12.57%和22.53%。Xanthomonadaceae的相對豐度T1處理為3.33%，T2和T3處理分別比T1處理增加了46.44%和109.74%。

細菌所占比例較高（相對豐度＞5%）的主要1個菌屬，為Rhodanobacter，介于2.69%～5.33%之間。T1處理Rhodanobacter的相對豐度為2.69%，T2和T3處理分別比T1處理增加了44.34%和98.15%。屬水平的細菌豐度在1%以上的有9個，分 別 為 Rhodanobacter、Candidatus_Solibacter、Rhizomicrobium、Bradyrhizobium、Bryobacter、Acidothermus、Telmatobacter、Candidatus_Koribacter和Isosphaera。

表2 不同施肥處理對煙田土壤中微生物的組成Tab.2 Composition and relative abundance of soil microorganisms in tobacco planting soil under different fertilizer treatments

續表2

續表2

2.5 不同施肥處理的聚類分析

如圖3可知，不同施肥處理的聚類分析，具有相似β多樣性的供試樣品聚類在一起，本研究各處理的結果主要聚類成兩大分支，T1和T2處理的幾個平行先行相聚，再依次與T3聚類。這說明稻草回田與單施化肥處理的細菌種類較接近，煙田再增施餅肥后土壤微生物多樣性表現出較明顯差異。

圖3 不同施肥處理煙田土壤微生物的β多樣性分析Fig.3 β diversity analysis of soil microorganisms in tobacco planting soil under different fertilizer treatments

2.6 不同施肥處理的細菌進化分支圖

如圖4可知，不同施肥處理對煙田土壤細菌進化分支有著不同的影響，從門至屬的分類級別由輻射的圓圈內至外，著色為黃色的無顯著差異物種所占比例較高，與之相比各處理中體現各自差異的微生物類群較少。各處理中起重要作用的微生物從門來看，T1處理起重要作用的細菌在門水平包括Elusimicrobia和Verrucomicrobia，在綱水平包括Acidobacteria、Elusimicrobia和Opitutae等；在目水平包括Nitrosomonadales、Subgroup_6和Subgroup_12等；在科水平包括Opitutales、Opitutaceae和SJA_28等。T2處理起重要作用的細菌在門水平未出現；在綱水平包括Elev_1554等；在目水平未出現；在科水平包括Methylocystaceae等。T3處理起重要作用的細菌在門未出現；在綱水平包括Flavobacteriia、Sphingobacteriia和Gammaproteobacteria等；在目水平包括Holophagaceae、DB1_14和Micrococcales等；在科水平包括Holophagales、Microbacteriaceae和Cryomorphaceae等。從而說明，單施化肥的煙田起重要作用的細菌主要是Elusimicrobia和Verrucomicrobia兩個門及其門下的細菌種群；化肥＋稻草回田處理煙田土壤表現的優勢細菌種群較少；而化肥＋稻草還田＋增施餅肥處理的煙田細菌在門水平未出現顯著的優勢種群，而在綱、目、科屬水平均有較多的優勢種群。

圖4 不同施肥處理的土壤微生物LEf Se進化分支圖Fig.4 LEf Se of soil microorganisms in tobacco soil under different fertilizer treatments

3 討論

土壤微生物在土壤中參與有機質和各種養分的分解與轉化，與土壤質量或肥力高低密切相關，而土壤細菌是土壤微生物的主要組成部分[22,23]。長期施用餅肥并覆蓋稻草，可有效增加土壤有機碳和氮含量，為土壤微生物活動提供足夠的碳源、氮源，并使土壤微生物數量持續增加，最終提高土壤養分有效性[24]。本試驗結果表明，長期施用餅肥并覆蓋稻草有利于提高烤煙土壤有機質、堿解氮和有效磷。

土壤微生物作為農田生態系統的重要組成部分，能夠對長期肥料累積作用產生敏感而快速的響應，是評價土壤質量和土壤肥力的重要指標。丁建莉等[25]研究結果表明在東北黑土的長期定位試驗條件下，土壤微生物多樣性受施肥類型的影響，與施加有機肥處理相比，單施化肥處理的土壤微生物多樣性略低。從本研究的各處理獨有OTU個數看，T1處理最少，為11個，而T2和T3處理均為13個，相對增加。由于土壤細菌群落結構易受有機肥料的影響，煙田施入有機肥導致土壤理化性質和微生物活性改變，從而改變了微生物群落多樣性[26,27]。從細菌α多樣性chao1指數看，與單施化肥相比，T2處理細菌多樣性有增加的趨勢，而增加餅肥施用的T3處理細菌多樣性表現下降。說明與單施化肥處理相比，由于有機物料還田為微生物代謝提供更多可供分解的植物殘體，進而促進了土壤微生物活性；另一方面，有機肥物料本身也帶入大量活的微生物，進而增加了土壤微生物的豐富性[28]，這與TIAN等[29]研究結果較為一致。有研究指出肥料的施用可以改變土壤微生物總量及菌群豐度[30]，單一施肥會導致微生物多樣性降低[31]，Zhou等[32]研究長期單施化肥對細菌群落結構的影響指出，單施化肥會減少細菌種群的豐度，而化肥與有機肥或綠肥秸稈長期配合施用，可改良土壤結構，增加土壤微生物的數量[33]；并且土壤微生物的組成、多樣性受到土壤其他各項因子（包括土壤pH、養分、碳組分含量等）的影響[34]。王光華等[35]和周嵐等[36]研究顯示，隨施氮水平的增加，氮肥減少了土壤中細菌群落多樣性及豐富度，與本研究結果一致。

Roesch等[37]研究指出農田土壤細菌微生物多樣性主要為豐度最高的Proteobacteria菌屬，而本研究結果表明，從細菌所占比例較高的相對豐度來看，主要的4個菌門依次分別為Proteobacteria＞Acidobacteria＞ Chloroflexi＞ Actinobacteria， 與 前人研究結果一致。Gammaproteobacteria的相對豐度在單施化肥處理較低（5.90%），與單施化肥處理相比，稻草還田處理和稻草還田并配施餅肥處理分別增加了34.43%和68.30%，與ZHAO J等[38]研究結果一致。Ktedonobacteria的相對豐度單施化肥處理較低（6.18%），稻草還田處理（6.55%）和稻草還田并配施餅肥處理（6.42%）的相對豐度在菌綱中也比較高，與康林玉等[39]的研究結果較為一致。主要原因可能是秸稈腐解過程中產生的產物（如蛋白質、糖類及維生素等）給微生物提供了豐富的營養，從而有利于Gammaproteobacteria等微生物生長。

微生物組成中，不同的菌種與土壤化學性質有著密切的關系，土壤中細菌豐富度受有機質含量的影響[40]，Proteobacteria（變形菌門）與土壤速效養分關系密切[41]，Actinobacteria（放線菌門）放線菌門菌群是土壤養分供給的主要來源[42]。與單施化肥處理相比，Proteobacteria和Actinobacteria的相對豐度在稻草還田處理和稻草還田并配施餅肥處理均有增加，而速效養分中堿解氮和速效磷含量也表現出稻草還田處理和稻草還田并配施餅肥處理均高于單施化肥處理，與前人研究結果較為一致，僅速效鉀含量表現為單施化肥處理最高。由于Chloroflexi（綠彎菌門）是礦區土壤生境生態循環的重要組成，與速效鉀有關[43]。而本試驗研究結果表明，Chloroflexi的相對豐度在單施化肥處理中要高于稻草還田并配施餅肥處理，這一研究結果與薛銀剛等的研究結果并不一致[44]，還需進一步證明。與單施化肥處理相比，Acidobacteria的相對豐度和土壤pH在稻草還田處理和稻草還田并配施餅肥處理的Acidobacteria相對豐度和土壤pH均有所降低，這與林耀奔等[45]在堿性土壤條件下研究在門水平中Acidobacteria（酸酐菌門）適宜在酸性環境中生存的結果并不一致；這可能與土壤性質有關，也可能是Acidobacteria對pH的適應有一定的范圍，太低的pH反而不利于其種群的增加。

本研究通過LEf Se進化分支圖還發現，在煙田微生物門水平組間差異相比，單施化肥比稻草還田和增施餅肥的Elusimicrobia（迷蹤菌門）和Verrucomicrobia（疣微菌門）兩個門物種較高。由于Elusimicrobia與水體溶解氧有關[46]，有機物質的微生物降解需要消耗溶解氧，農田施用稻草或餅肥增加了農田有機物質，但是在微生物降解過程中這些有機物質已經將水中的氧氣提前消耗，致使溶解氧用量不夠，而復氧就是為了及時補償這種不平衡的溶解氧虧損，從而抑制了Elusimicrobia生長[47]。胡中華等[48]認為化肥污染是面源污染的一個重要方面，而Verrucomicrobia與土壤環境因素有關，本試驗研究結果表明，單施化肥的煙田有顯著物種Verrucomicrobia，與前人研究結果一致。雖然稻草回田再增加餅肥施用降低了chao1指數，土壤細菌多樣性有所下降，但其在綱、目、科屬水平均有較多的優勢細菌種群出現。

4 結論

（1）不同施肥類型對植煙土壤化學性質有著不同的影響，稻草還田和稻草還田并添加餅肥能夠改善植煙土壤化學性質，稻草還田并添加餅肥最有利于提高土壤有機質、堿解氮和速效鉀含量，降低土壤pH值。

（2）不同施肥方式對土壤細菌α多樣性影響較小，但與單施化肥相比，稻草回田或再增加餅肥有利于提高獨有OTU個數。

（3）不同施肥類型對植煙土壤微生物組成的影響，細菌所占比例較高的主要4個菌門，Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi 和Actinobacteria，而Proteobacteria菌門和菌門下物種的相對豐度最高，其中與單施化肥相比，稻草回田或再增加餅肥的植煙土壤Proteobacteria菌門相對豐度高，尤其是稻草還田并添加餅肥的煙田最高。

（4）不同施肥方式對植煙土壤微生物LEf Se進化分支圖有明顯影響，單施化肥的煙田土壤細菌表現優勢的細菌種群主要是Elusimicrobia和Verrucomicrobia兩個門及其門下的細菌種群；化肥＋稻草還田處理土壤獨有的優勢種群較少；化肥＋稻草還田＋餅肥處理的煙田土壤在綱、目、科屬水平表現較多的優勢細菌種群。