外泌體中miRNA 介導(dǎo)動脈粥樣硬化及中藥干預(yù)作用的研究進(jìn)展

趙立鳳 俞 琦 于紅紅 田維毅

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽550002）

動脈粥樣硬化（AS）是一種常見的慢性炎癥性疾病，其基本病變是在動脈內(nèi)膜面形成斑塊，有脂質(zhì)條紋、纖維斑塊和粥樣斑塊，繼續(xù)加重可出現(xiàn)鈣化、粥樣潰瘍形成、血栓形成和斑塊內(nèi)出血等繼發(fā)性病變，尤其后2 種都是心腦血管事件的常見因素［1］。外泌體（exosome）廣泛存在于人體體液中，可通過細(xì)胞間通訊將信息傳遞給鄰近或遠(yuǎn)距離的靶細(xì)胞，miRNA 是外泌體中的一種內(nèi)容物，在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為反應(yīng)以及基因靶標(biāo)的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，可作為關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)和分子調(diào)控途徑參與AS 的發(fā)生發(fā)展。近年來，外泌體對AS 的影響方面的研究日益增多，它可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞極化、血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及血小板活性等多個方面參與AS的發(fā)生發(fā)展過程，本文對此進(jìn)行綜述。

1 外泌體的命名及功能

1986 年，Trams 和Johnstone 在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)命名為外泌體［2］，是由活細(xì)胞衍生的直徑為30～100 nm 的膜性囊泡［3］，不同來源的細(xì)胞類型在正常或病理狀態(tài)下均可分泌［4］。外泌體內(nèi)含有微小 RNA（miRNA）、rRNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，能夠在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，是腫瘤、心血管疾病的標(biāo)志物。外泌體作為細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞的重要信息載體，參與調(diào)控細(xì)胞的生理活動。

2 外泌體中的miRNA

miRNA 是外泌體中的一種內(nèi)容物，是一組廣泛的非編碼單鏈小RNA 分子，截至目前，在動物、植物和病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有2 萬多個。miRNA 可減少mRNA 的轉(zhuǎn)錄，并在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)過程中及調(diào)控細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖以及凋亡等多個細(xì)胞生物學(xué)行為反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用［5］。miRNA 可調(diào)節(jié)基因靶標(biāo)（例如癌基因和腫瘤抑制基因）的表達(dá)，并充當(dāng)具有mRNA 結(jié)合和切割的基因抑制因子。在病理情況下，不同細(xì)胞來源的外泌體中miRNA 的表達(dá)水平有所差異［6］，因此，miRNA 是近年來探究AS 發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的一個研究熱點(diǎn)。

3 外泌體中miRNA 對動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)

大量研究表明，AS 是由多種內(nèi)在因素相互作用所致的慢性炎癥性疾病，當(dāng)前也有越來越多的研究認(rèn)為其還與外泌體通過外來途徑的影響密切相關(guān)［7］。但在AS 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，不同來源細(xì)胞分泌的外泌體中miRNA 具有不同甚至相反的作用，其中一部分促進(jìn)，一部分抑制。在后續(xù)的研究中探索清楚是哪些外泌體在AS 發(fā)生發(fā)展過程中起作用，這對診斷和治療具有重要意義。

3.1 外泌體中miRNA 對炎癥反應(yīng)的影響 慢性炎癥貫穿AS 發(fā)生發(fā)展的整個過程，是一個關(guān)鍵因素，但是其具體機(jī)制尚未明確，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA 可能是炎癥反應(yīng)過程中重要的一環(huán)。Wang 等［8］發(fā)現(xiàn)，THP?1 衍生的巨噬細(xì)胞中miR?9 的靶基因為JAK1 和MMP?13，miR?9 可通過JAK1／STAT1 信號通路抑制NLRP3 炎性體的激活并減輕AS炎癥。因此，miR?9 可以作為AS 的潛在治療靶標(biāo)。另有研究表明，MiR?188?3p 可減少ApoE-／-小鼠的血管內(nèi)脂質(zhì)積聚，減輕巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少促炎因子的表達(dá)，同時增加ABCA1 和KLF2 水平，此實驗通過研究miR?188?3p對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化的抑制作用，發(fā)現(xiàn)了一種新的AS 潛在療法［9］。

另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體也具有促炎作用。THP?1 源性巨噬細(xì)胞中miR?134 通過ANGPTL4／LPL 途徑促進(jìn)脂質(zhì)積聚和促炎性細(xì)胞因子的分泌，從而加劇AS 的發(fā)生發(fā)展。因此，靶向miR?134 可能為預(yù)防和治療AS 性心血管疾病提供了新的策略［10］。

綜上所述，外泌體中的miRNA 部分能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，部分能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，通過增強(qiáng)或抑制炎癥反應(yīng)，從而相應(yīng)的加劇或延緩AS 的發(fā)生發(fā)展。

3.2 外泌體中miRNA 調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 miRNA 作為一種小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)，可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)血管的生理病理過程中發(fā)揮重要作用。Burger 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮集落形成細(xì)胞衍生的外泌體中富含miR?486?5p，能夠靶向抑制腎臟組織在I／R 條件下張力蛋白同源物的表達(dá)水平，阻止其通過AKT 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞衍生的外泌體可以通過介導(dǎo)miR?150 轉(zhuǎn)移來控制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［12］，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外，在ApoE-／-小鼠的As 模型中還發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR?126 可以減少斑塊面積［13］。

與之相反，也有研究表明外泌體中的miRNA 可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起內(nèi)皮功能障礙。Goodwin 等［14］對外泌體中膿毒血癥相關(guān)miRNA 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示膿毒血癥患者的miR?34a 表達(dá)較健康人顯著升高，而miR?15a 和miR?27a 有所下降，說明外泌體誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的衰老與凋亡。

綜上所述，外泌體對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，其功能的體現(xiàn)可能與所來源的細(xì)胞種類、細(xì)胞內(nèi)部攜帶的具體成分和不同類型及強(qiáng)度的外界刺激有密切關(guān)系。

3.3 外泌體中miRNA 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化 巨噬細(xì)胞在不同刺激因素的作用下，為滿足機(jī)體的不同需求可轉(zhuǎn)化成具有不同功能表型的巨噬細(xì)胞，這個過程稱為極化。Yang等［15］研究表明，miR?216a 通過激活端粒酶Smad3／NF?κB促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化和AS 進(jìn)展。Zhuang 等［16］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中miR?223 能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，通過抑制Pknox1 促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化，是關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中miR?378a 通過直接或間接方式調(diào)節(jié)信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬和極化作用，這可能為促進(jìn)巨噬細(xì)胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制AS 的進(jìn)展提供了新的途徑［17］。

3.4 外泌體中miRNA 調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化 血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）在生理情況下的表型為收縮型，在一定的內(nèi)外因素刺激下，VSMC 表型由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，是AS 發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。miRNA 是VSMC轉(zhuǎn)化的分子開關(guān)，可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)VSMC 表型轉(zhuǎn)化。Cheng 等［18］通過研究體外培養(yǎng)的大鼠VSMC 和體內(nèi)球囊損傷的大鼠頸動脈，證實miR?145 可上調(diào)鈣調(diào)蛋白及平滑肌肌動蛋白等VSMC 分化標(biāo)志物基因的表達(dá)，是一種新的表型標(biāo)記和VSMC 的新的表型調(diào)節(jié)劑。Torella［19］等發(fā)現(xiàn)，miR?133 在體外和體內(nèi)VSMC 實驗中均表達(dá)增強(qiáng)，是VSMC 表型轉(zhuǎn)化的一個重要調(diào)節(jié)因子，能有效抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化。

3.5 外泌體中miRNA 調(diào)節(jié)血小板活性 血小板活化、黏附和聚集亦是AS 發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。通過對As 患者服用抗血小板藥物阿司匹林的研究中發(fā)現(xiàn)，血小板外泌體中的miR?126 和miR?223 的表達(dá)水平均降低［20?21］。有研究選取了血小板中miR?200b、miR?495、miR?107 這3 種miRNA與其相應(yīng)的靶基因相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)三者均可通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)影響血小板活性［22］。這些研究表明，部分miRNA能夠調(diào)節(jié)血小板活性，有望成為AS 治療的潛在標(biāo)志物。

4 外泌體負(fù)載中藥對動脈粥樣硬化的防治及對其他疾病的影響

中藥可通過多途徑、多位點(diǎn)對靶器官進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到預(yù)防、治療疾病的目的。外泌體有膜包裹，所運(yùn)載的物質(zhì)不會輕易被蛋白降解，這對中藥發(fā)揮更好的療效具有重大意義。

4.1 姜黃素 姜黃素是來自植物姜黃（姜科）的根莖中的一種天然多酚，長期以來被用于治療炎癥相關(guān)的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載有姜黃素的外泌體能夠通過載脂蛋白A1與ATP 結(jié)合盒蛋白A1 介導(dǎo)途徑使細(xì)胞內(nèi)的低密度脂蛋白流出量增加，可降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，并且還發(fā)現(xiàn)由外泌體搭載的姜黃素的藥物療效增加［23］。Ma 等［24］發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅能有效抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子TNF?α、IL?6 的表達(dá)，還可抑制RAW264.7 巨噬細(xì)胞與THP?1 源性巨噬細(xì)胞中miR?155 的表達(dá)；通過阻斷PI3K／AKT 信號通路，可導(dǎo)致miR?155 水平降低，說明姜黃素抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用可能與抑制miR?155 的表達(dá)有關(guān)。

4.2 補(bǔ)陽還五湯 補(bǔ)陽還五湯在臨床上用于治療偏癱和中風(fēng)，最近研究發(fā)現(xiàn)，該方干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）衍生的外泌體時，能激活血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，誘導(dǎo)miR?126 的表達(dá)，抑制miR?221 和miR?222 的表達(dá)。另外，在大鼠雙側(cè)頸動脈結(jié)扎后，補(bǔ)陽還五湯干預(yù)的MSCs 的外泌體可以促進(jìn)大鼠Ki?67 和腦內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，使血管密度增加，可促進(jìn)缺血區(qū)腦血管的生成，改善缺血癥狀［25］。

4.3 丹皮酚 丹皮酚是一種從中藥牡丹皮中分離出來的活性化合物，可調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能和保護(hù)血管細(xì)胞的損傷，已被證明具有抗AS 的作用［26］。Liu 等［27］在體內(nèi)實驗中證實，丹皮酚抑制了ApoE?／?小鼠AS 的發(fā)展，增加了miR?223 的表達(dá)，抑制了STAT3 通路；在體外實驗中，丹皮酚抑制了HUVECs 中的炎癥分泌、黏附和STAT3 的表達(dá)，可在miR?223 抑制劑轉(zhuǎn)染入THP?1 細(xì)胞后逆轉(zhuǎn)，說明丹皮酚可以通過增加HUVECs 中miR?223 的表達(dá)，降低HUVECs 中IL?1β、IL?6、ICAM?1、VCAM?1 的表達(dá)，并減輕THP?1 細(xì)胞與HUVEC 的黏附，從而抑制AS 的發(fā)生發(fā)展。

4.4 紫草素 紫草素是從中藥紫草中分離出的萘醌，可通過減弱氧化應(yīng)激抑制炎癥反應(yīng)、抑制DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞生長［28］。Wei 等［29］分析了乳腺癌細(xì)胞MCF?7 衍生的外泌體中的miRNA 譜，發(fā)現(xiàn)一些miRNA在外泌體中被特異性分選和豐富。通過敲除外泌體中最豐富的miRNA 和MCF?7 增殖試驗發(fā)現(xiàn)，外泌體中miR?128 負(fù)調(diào)節(jié)MCF?7 受體細(xì)胞Bax 水平，并抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，紫草素通過減少腫瘤細(xì)胞來源的外泌體miR?128的表達(dá)抑制MCF?7 的增殖。

4.5 三七總皂苷 三七是屬于五加科的一種中藥，臨床上常用于心腦血管疾病方面的治療，三七總皂苷（PNS）已被證實是藥材發(fā)揮心臟保護(hù)作用的主要有效成分。PNS 可顯著減弱異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌損傷和纖維化，在ISO 處理的小鼠心臟中miR?29c 表達(dá)顯著降低，而PNS處理后其表達(dá)增加，表明PNS 的心臟保護(hù)作用可能是由于升高miR?29c 表達(dá)所致，這可有助于加強(qiáng)對PNS 治療心血管疾病活性的理解［30］。

4.6 甘草 Xiang 等［31］從甘草煎劑中提取miRNA 和合成的miRNA 模擬物，用于干預(yù)從健康志愿者分離的外周血單核細(xì)胞，通過RT?PCR 分析Toll 樣受體、轉(zhuǎn)錄因子、信號分子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)，結(jié)果顯示甘草miRNA 通過抑制參與T 淋巴細(xì)胞分化、炎癥和凋亡基因的表達(dá)，可以顯著調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞。

5 總結(jié)與展望

外泌體可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞極化、血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及血小板活性等多個方面參與AS 發(fā)生發(fā)展過程，其中miRNA 在AS 病理過程中扮演著重要角色，已引起越來越多研究者的關(guān)注。研究表明，外泌體中的miRNA 的表達(dá)水平既可以調(diào)控AS 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，也可以反映其療效。中醫(yī)藥以整體觀念及辨證論治為指導(dǎo)，通過多位點(diǎn)、多途徑整合起效，對于復(fù)雜性疾病的治療具有獨(dú)特優(yōu)勢。然而，目前國內(nèi)外對外泌體負(fù)載中藥治療AS 的研究幾乎處于空白狀態(tài)，故更深入地研究外泌體中miRNA 在AS 過程中的作用機(jī)制，并將其作為中藥有效成分的載體，可能是相關(guān)診斷和治療的新型生物標(biāo)記物，以及相關(guān)研究新的著力點(diǎn)和新靶標(biāo)，還可能使miRNA 成為藥靶，或模擬miRNA 進(jìn)行新藥開發(fā)，具有很大的探索潛力和應(yīng)用價值。