RSSs的組成和特征對體細胞V(D)J基因重排效率的影響①

姚新生 (遵義醫科大學免疫學教研室，遵義 563003)

TCR/BCR的V(D) J基因體細胞重排主要依賴于重組激活基因(recombination-activating genes，RAG)酶等對重組信號序列(recombination signal sequences，RSSs)的識別、剪切和連接，RSSs由12 bp 或23 bp的非保守間隔子(spacer)、分離保守的7聚體(heptamer)和9聚體(nonamer)組成，分別稱為12RSSs(7-12-9)和23RSSs(9-23-7)，體內V(D) J重組一般只發生在12RSSs～23RSSs間，即重組“12/23規則”[1-3]。

RSSs中，heptamer的保守或共識序列為CACAGTG,noname的保守或共識序列為ACAAA-AACC,V(D)J重組分為兩個階段,第一階段為DNA的識別和剪切，第二階段為DNA的分裂和結合,鈍的信號末端形成閉環鏈接，編碼末端按共價密封連接形成重排產物[3-5]。

RSSs側翼的基因片段是等效參與重組的，但多項研究證實，抗原選擇前的V(D)J重組并非隨機重排，保守的heptamer、noname序列、規則的12 bp/23 bp 間隔子長度、RSSs的近端/遠端重組基因間距等與V(D)J取用頻率密切相關，形成V(D)J表達頻率差異的TCR/BCR組庫[6-11]。T、B細胞發展抗原與配體自我耐受選擇和克隆增生應答導致V(D)J取用頻率進一步改變[12-14]。

因體內RSSs對TCR/BCR初始重排中V(D)J 取用影響極為復雜，現有研究多數集中于外周細胞系，體內的影響效果和機制尚未闡明。外周TCR/BCR組庫V(D)J取用頻率和抗原的關系、初始重組導致V(D)J取用差異，導致外周TCR/BCR組庫的機制與意義研究結論存在偏差。

1 RSSs簡介

TCR/BCR的多樣性源于體胚系V(D)J基因在體細胞水平上的重排，重排的發生由2個重組基因上非編碼“特殊DNA序列”引導，此“引導序列”在脊椎動物的進化過程中高度保守，被命名為RSSs，每個RSSs由12 bp或23 bp的非保守間隔子分離保守的7聚體和9聚體組成，12RSSs組成為：heptamer-12 bp spacer-nonamer(7-12-9),23RSSs組成為：nonamer-23 bp spacer-heptamer(9-23-7)。

TCR/BCR重組基因片段中，各V基因片段的3′端和各J基因的5′端各進化出1個RSSs，各D基因的5′端和3′端分別進化出1個RSSs，以人TCR/BCR的V(D)J為例，進化所形成的RSSs特征如下：IGHV-7-23-9、9-12-7-IGHD-7-12-9、9-23-7-IGHJ、IGKV-7-12-9、9-23-7-IGKJ、IGLV-7-23-9、9-12-7-IGLJ、TRBV-7-23-9、9-12-7-TRBD-7-23-9、9-12-7-TRBJ、TRAV-7-23-9、9-12-7-TRAJ、TRDV-7-23-9、9-12-7-TRDD-7-23-9、9-12-7-TRDJ、TRGV-7-23-9、9-12-7-TRGJ；D基因進化中，人IGHD的兩端RSSs均為9-12-7，而TRBD兩端RSSs分別為9-12-7和7-23-9；V基因進化中，IGKV的RSSs為7-12-9，其他V基因的RSSs均為7-23-9；J基因進化中，IGKJ和IGHJ的RSSs為9-23-7，而其他J基因的RSSs均為9-12-7。此差異是如何進化而來及其對重組的意義為何尚未闡明。同一個重組基因片段及其RSSs間可能存在不同的進化模式，具有不同的進化起源[15，16]。人TCRα和TCRδ的重組基因分散于同一條染色上的，Haynes等[17]研究發現TCRδ IG輕鏈片段具有相似的CDR2序列，提示其可能存在相似的進化歷史。

RSSs中保守的heptamer序列組成為CACA-GTG,保守的noname序列為ACAAAAACC,規則的間隔子長度為12 bp或23 bp。但不同物種間和不同的V(D)J重組基因，其RSSs組成多數并非“保守”和“規則”，heptamer、nonamer、spacer的堿基序列在相同或不同的位點上多數存在1個以上堿基突變。同一物種V(D)J的多個等位基因上，其7-12-9或9-23-7組成存在差異，即1個個體的2條等位基因上V(D)J的RSSs可能是不同的，如人IGHJ5 基因片段目前發現2個等位基因：IGHJ5*01(登陸號：M25625)和IGHJ5*02(登陸號：X97051)，IGHJ5*01 RSSs組成為:GTTCTTTGT-21 bp spacer(CGGGGTCTGGCATTGTTGTCACAATGTG)，IGHJ5*02 RSSs組成為:GTTCTTGCC-22 bp spacer(TGGGGTCCTGGCATTGTTGTCACAATGTG)，V(D)J基因片段的多樣性和RSSs組成和特征的復雜性導致體內系統研究RSSs對V(D)J重排效率影響較為困難。RSSs主要通過與RAG蛋白相互作用啟動并調控V(D)J重排,在B和T細胞發育過程中，RAG1/2蛋白復合物在保守重組信號序列(RSS)處切割DNA，啟動V(D)J重組，RAG1/2也能催化含有RSS的底物轉位鏈轉移至靶DNA，形成支鏈DNA中間產物(發夾形成或去除轉位的供體DNA)，重組遵循“12/23規則”和“B 12/23 規則”，以人IGH的V(D)J中RSSs為例，重組僅發生在D-J和V-D之間[1,2,18,19]。

RSSs進化的組成特征中，heptamer總是直接相鄰V(D)J基因，2個重組基因片段的heptamer末端以頭對頭的方式連接形成精確的“信號接頭”，2個重組基因片段的編碼端形成不精確的“編碼接頭”。參與重組識別、剪輯、連接的蛋白主要有:RAG1、RAG2、異二聚體(heterodimer)Ku70-Ku80、DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)、DNA連接酶Ⅳ (DNA ligase Ⅳ，XRCC4)、脫氧核苷酸末端轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT) 等[15，16]。

RSSs調控重組過程的效率和機制研究多數在體外細胞系中進行，通過分析RAG和RSSs的結合率、監測RSSs斷裂末端及發夾形成等過程進行分析[20，21]。

2 hepatamer與nonamer對重組V(D)J基因利用的影響

根據脊椎動物進化過程中hepatamer與nonamer的保守堿基序列組成以及目前所獲取的不同物種、不同重組基因、不同個體的等位基因組成和特征(均存在1個或以上的堿基突變)，可通過體外人工突變技術對部分堿基進行研究，發現hepatamer與nonamer對重組中V、J的利用具有重要影響。

Hesse等[9]與Steen等[22]研究發現，在V(D)J重排過程中，heptamer對發夾的形成起關鍵作用，heptamer或將heptamer整體突變將無法形成發夾。通過DNA回文序列上的heptamer組成分析發現，heptamer的7個堿基中，連接位點附近的3個核苷酸(GTG/CAC)在BCR和TCR基因中幾乎100%保守，其他位點的核苷酸僅63%～86%保守，可轉變為其他核苷酸，但并不會失去底物活性，當heptamer最后4個位點的堿基順序改變時，重組基因形成刻痕和發夾的效率降低至少2倍。當保留heptamer，但用隨機序列替換nonamer，發現仍能檢測到刻痕和發夾形成，但DNA分裂顯著減少，提示準確的切割(刻痕和發夾形成)主要依賴于heptamer，尤其是前3個位點的堿基組成。盡管研究發現heptamer前3個堿基突變后依然能與RAG1和RAG2結合，但刻痕和發夾形成明顯減少，推測heptamer的作用機制可能直接參與DSB形成的化學步驟，第1位和第3位堿基的突變反式形成減少[9，22]。Ramsden等[23]認為heptamer作用效率依賴于nonamer，nonamer在重排的初始綁定后，heptamer才能發揮作用。

為詳細探討人heptamer的7個位點堿基組成及各位點堿基的作用和效果，Akamatsu等[24]研究提示，heptamer前3個堿基突變將降低重組的連接率,與重組位點相鄰的第1個堿基最為重要，但重組位點的特異性和前3個堿基較小，與野生型相比，當heptamer 7-1G處突變后，體外實驗無法檢測到重排;當heptamer第2位點(7-2T)和第3位點(7-3G)突變，可檢測到重組水平分別為0.5%和0.6%;當heptamer第5位點G殘基突變為C(7-5C)時，重組水平下降至5.9%；當heptame其余殘基突變時，重組水平下降至28.5%～52.0%[10]。Nagawa等[20]通過檢測5種heptamer突變體，發現heptamer中第1和第2位點的突變減少發夾的形成。heptamer的作用依賴于規則的12和23間隔子，Akira等[11]通過構建包含合成RSSs的重組底物，并導入Pre-B細胞系，發現如果滿足12堿基和23堿基間隔子規則，兩組heptamer(CACTGTG)和(GGTTTGT)序列都能引起V(D)J連接，但當heptamer序列中1個位點突變，將顯著減少重組的發生。

nonamer調控V(D)J重組的效果和方式同heptamer區別較大，Akamatsu等[10]發現，nonamer調控V(D)J重組，主要依賴于nonamer中的“A-rich core”，3個連續的A堿基是形成有效重組的必要條件，且兩側的核苷酸需要多個堿基才能滿足重組酶測量heptamer和nonamer距離的要求，以滿足12/23 bp間隔子規則啟動重排，當nonamer中心位點堿基發生突變，如9-4G(A變為G)，重組頻率僅下降至對照組的27.3%，9-5C(A變為C)時下降為10.4%，雙突變(9-3G/4G)時下降至19.3%，雙突變(9-6G/7G)時下降至26.0%。但當9-4G/5C和9-5C/6G雙位點突變，未檢測到重組發生[10]。對于nonamer的“A-rich core”不同位點堿基的突變研究結果，Akamatsu等[10]認為第5位點處A堿“A-rich core”最為重要。而Hesse等[9]認為第6位點處A堿基最為重要。Steen等[22]發現保守的nonamer(ACAAAACC)序列中單個堿基位置的改變可能影響V(D)J重組中DSB水平，其中第5個位點突變只對DSB有中等影響,第6個位置突變會顯著降低突變反式DSB水平，結果和Hesse等[22]一致。nonamer側翼堿基位點突變對V(D)J重組影響的研究中發現，C突變為A(9-2A)時，重組頻率降低至對照水平的2.7%；C突變為T(9-2T)時，頻率下降至12.9%；C突變為G(9-2G)時，頻率保持為61.3%；當2個C殘基均改變為G(9-8G/9G)時，重組頻率為65%；當兩個C殘基都變為A(9-8A9A)時，頻率下降至0.1%以下。提示以上側翼C堿基可能在重組酶測量heptamer和nonamer間距離時起重要作用[10，24，25]。同時，nonamer除保守位置外的其他位點突變可導致重組DNA分裂水平降低[9，26]。

在heptamer和noname調控V(D)J重組的研究中機制，重組主要來源于其與RAG間的相互作用。Jessica等[27]發現只有RAG1/2最初組裝在單個RSS上的復合體才能導致12RSS-23RSS組合，激活分裂；Nagawa等[20]發現nonamer突變體可能通過DNase I 影響其和RAG1相互作用，部分nonamer突變能清除RSS-RAG1的相互作用；Agrawal等[28]發現RAG1與noname中的特定堿基相互作用，且相互作用延伸至相鄰的間隔子，但未闡明RAG2和RSS存在交互作用，RAG1對heptamer的保護是局部的，只有在12RSS和23RSS間形成突觸復合體后，才能穩定地與RAG蛋白相互作用。Ramsden等[23]認為RSS中單個成分具有不同功能，nonamer在RAG蛋白的結合中起重要作用，而有效的刻痕和發夾形成則需要heptamer序列，heptamer對分裂的化學步驟至關重要，在信號編碼邊界周圍裂解DNA是啟動V(D)J組合的必要條件。Difilippantonio等[29]發現RAG1蛋白中的Hin結構域與RSS的nonamer相互作用，參與V(D)J重組。

Hesse等[9]利用質粒將DNA導入Pre-B細胞，證明重組獨立于任何特異染色體背景，包含heptamer-nonamer的84 bp和42 bp側翼鼠基因片段均能發生重組，提示V(D)J重組對位點的拓撲排列相對不敏感。Hiroshi等[30]發現CpG甲基化對RAG1/RAG2和RSS的反應產生影響，直接和間接控制V(D)J分裂。

3 12/23 spacer長度和序列對重組V(D)J基因利用的影響

“12/23 規則”是V(D)J重組的必要條件，不同物種、不同重組基因、不同個體等位基因研究發現，RSSs的12 bp或23 bp長度存在至少1個堿基突變，而spacer的堿基序列存在不同的組成，12/23 spacer長度和序列調控V(D)J重組的效率和機制已被廣泛研究。

12和23 間隔子的長度改變對V(D)J重組的影響研究中，Akamatsu等[10]發現在11 bp的RSSs中，重組頻率下降至野生型的7.7%，在12 bp RSSs中加入1個C堿基(13RSSs)，重組頻率為11.0%，當添加2個C堿基(14RSSs)時，未能檢測到重組的發生，提示RSSs長度在重組效率中關鍵作用。Akira等[11]發現23 bp和12 bp2種間隔子長度(21 bp/22 bp/23 bp /24 bp與11 bp/12 bp/13 bp)的組合變化將減少重組的發生；Steen等[22]發現 23 間隔子長度中，1個核苷酸(23 bp+1 bp)改變，in cis和in trans均適度地減少了DSB的形成；如果改變間隔子長度超過1個核苷酸(23 bp-2 bp和23 bp-3 bp)，將嚴重減少和突變反式分裂；如果12 bp和23 bp同時改變(12 bp-3bp/23 bp-3 bp)，將無法檢測到DSB的發生；如果將heptamer(H-6G、H-7T)、間隔子加1 bp和nonamer(N-5G)進行組合改變，突變反式的高效重組中DSB的形成將嚴重減少。Ramsden等[23]發現nonamer距離heptamer 18 bp或29 bp時，將干擾heptamer分裂，無nonamer情況下可觀察到刻痕，但發夾形成減少，nonamer和heptame間隔34 bp時，重排中兩者依舊存在協作關系。

12/23 spacer序列的改變對V(D)J的影響較為復雜，Fanning等[31]通過改變IGKV的12RSSs(CTACAGACTGGA)的第5位堿基，將其由A變為C(CTACCGACTGGA)時，與其重組的IGKJ 23RSSs(GTAGTACTCCACTGTCTGGCTGT)不變，突變的近端RSSs使用頻率從54%降低至37%,提示RSSs間隔序列影響V(D)J的重組較率。Montalbano等[32]認為間隔子序列在RSS的重組效率中起重要作用，主要發生在RAG結合RSSs之后，間隔序列中的單堿基突變能顯著影響其重組效率，通過研究非常規的RSSs(12RSSs第6、11、12位分別為ATCG時，23RSSs第3、5、8、11、21位分別為GTTGT時)發現，與保守RSSs相比,其結合RAG蛋白的效率降低2倍。

Larijani等[33]發現間隔子中的某些位置存在適度守恒，間隔子序列變化可能影響重組頻率改變為6倍以上；Steen等[22]發現12RSSs 3種突變(12-1T、12-1A和12-1G)將會取消順突變重組中DSB形成。Akira等[11]發現，當12RSSs的間隔子被轉換為人工序列時(GATCGATCGATCS)，重組效率不變，間隔子序列影響重組基因頻率的作用有限。

Feeney等[34]認為，體內間隔序列中發生自然變異可能有助于體內觀察人V基因的非隨機使用，人V基因間隔子序列中隨機產生的變異導致其重組效率降低；Nadel等[8]認為間隔子序列是引發重排頻率的決定因素，體外不同人V、K基因片段重組率可能與其在體內的Pre-B細胞中的重排頻率相關。Posnett等[35]直接根據外周V基因家族相對應T細胞的比例發現，人TRBV3的2個等位基因在RSSs的23 bp spacer間隔區內的1個單核苷酸位點存在“C/T”差異,導致外周血中TRBV3細胞變化，TRBV3等位基因為純合子“T”個體，TRBV3細胞數為8.1%，雜合子個體(C/T)TRBV3細胞占比為4.7%，等位基因為純合子 “C”個體平均TRBV3細胞數為1.2%,提示間隔區序列改變影響重組效率。在12和23間隔子調控的機制上。Joydeep等[36]認為RAG蛋白檢測V(D)J分裂的步驟，初始RAG結合可能發生在含有12 bp或23 bp間隔子的RSSs上。

4 RSSs間距離對重組V(D)J基因利用的影響

重組V(D)J基因片段分散于染色體，重組的2個基因片段來源于同一條染色體上不同位置，重組的首要條件為RAG對單RSSs的識別后，按“12/23”規則尋找配對的目標RSSs基因片段。研究證實參與重組基因片段近端和遠端配對的基因表現出不同的重組效率[37-39]。

Yancopoulos等[7]在前B細胞系的研究體系中發現大多數IGHJ近端的IGHV基因片段優先用于V(D)J重排,表明IGHV基因片段的重組頻率受其在染色體上位置影響，在前B細胞(初始庫)中表達與成熟B細胞群具有顯著差異；Perlmutter等[40]發現胎兒雜交瘤系來源的Pre-B細胞選擇到DJH重排的IGHV基因片段具有偏向性，多數IGHJ近端的IGHV基因片段被優先使用。Reth等[41]發現B細胞系初始HD和HJ重排使用了更多的3′D段，但一旦形成1個HD-HJ復合物(DJ替代重排)后,則優先使用最多的5′D段。

Feeney等[42]發現V(D)J重排中，遠端區域V基因重排頻率較低，86個cDNA序列中只有2個來自遠端，51個非有效性DNA序列中3個來自遠端區域，但IGKJ近端和遠端基因片段重排無顯著區別；Malynn等[43]發現在胎兒發育早期，IGHV序列具有明顯偏差，且可持續至出生后5～7 d。成人骨髓B細胞初始庫中，IGHJ近端的IGHV基因片段存在表達優勢，提示成人脾臟B細胞IGHV差異主要來源于初始重排時的選擇，而不是重排后表達頻率改變造成的差異；Raaphorst等[44]發現胎兒胸腺和肝臟、骨髓、脾臟和臍血中TCRβ CDR3區域中，TRBJ2.1具有較高的利用頻率，可能與其靠近D或V有關。

5 展望

TCR/BCR的多樣性是適應性免疫應答研究的核心，V(D)J基因片段的表達頻率與自身耐受的選擇及克隆增生的應答關系備受關注，但初始TCR/BCR組庫中，V(D)J參與重組的取用差異較為復雜，進展較少甚至被忽略，導致外周TCR/BCR研究V(D)J取用的意義和機制研究出現偏差。

隨著高通量測序對體內T/B細胞組庫(CDR3受體庫)解析的進展，近年來，本課題組對比分析人和鼠中樞及外周T/B細胞CDR3組庫，對功能性基因、假基因、RSSs等參與重排的效率和取用原則進行了初步探討，可為體內研究V(D)J重組提供基礎數據和新的技術[45-47]。目前，關于RSSs和V(D)J的進化、個體等位基因的多樣性、重排調控的機制及初始庫與生理/病理應答的關系等的研究較少，有待進一步研究。