洋薊素對對乙酰氨基酚誘導的大鼠藥物性肝損傷的影響①

張曉文 鄭思琪 馬應卓 李 帆 李娟芳 (商洛學院，商洛 726000)

藥物誘導的肝損傷是指通過某些藥物或其代謝物誘導的急性或慢性肝損傷，如今，藥物性肝損傷已成為急性肝損傷的最常見原因，也導致了藥物不良反應[1]。嚴重的肝損傷可能導致肝功能衰竭甚至危及生命，因此，針對藥物性肝損傷尋找一種效果顯著且安全的藥物是十分重要的。對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)常用做解熱鎮(zhèn)痛藥，當以治療劑量使用時，它是安全有效的，然而，由于過度使用APAP，實驗動物和人類均可誘發(fā)嚴重的肝損傷[2]。由于其常見和實驗簡單，目前廣泛用于臨床建立藥物性肝損傷動物模型[3]。洋薊素又稱朝薊素，洋薊酸，是提取自中藥菜薊的一類咖啡酰奎寧酸類化合物，具有抗氧化、抗微生物、利膽和保肝作用[4]。其利膽和保肝作用通常與洋薊素的含量有關[5]。目前尚未有研究發(fā)現關于洋薊素對藥物性肝損傷是否具有治療作用。本文旨在研究洋薊素對APAP誘導的大鼠藥物性肝損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 60只SD大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，雄性，12周齡，體質量(200±10)g，許可證號：SCXK(粵)2018-0002，置于溫控(22±1)℃和光控(200 lux，12 h光暗循環(huán))動物設施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2藥物與主要試劑 洋薊素購自美國Sigma-Aldrich，化學式：C25H24O12，分子量：516.45，純度≥98.0%；APAP購自中國食品藥品檢定研究院；N-乙酰半胱氨酸購自上海晶都生物技術有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；天門冬氨酸氨基轉移酶測試盒、丙氨酸氨基轉移酶測試盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、一氧化氮測定試劑盒、總超氧化物歧化酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶均購自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒均購自美國Abcam公司。

1.1.3儀器 酶標儀(318C+)購自上海沛歐分析儀器有限公司；可見分光光度計(V-1500PC)購自上海添時科學儀器有限公司；熒光顯微鏡(DYF-680)購自上海點應光學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立和分組 將大鼠隨機分為6組：對照組(Control)、模型組(Model)、洋薊素低劑量組(Cynarin 50)、洋薊素中劑量組(Cynarin 100)、洋薊素高劑量組(Cynarin 150)、N-乙酰半胱氨酸組(N-NAC)。洋薊素組尾靜脈注射APAP300 mg/kg，每日灌服洋薊素10 ml(50、100、150 mg/kg)或N-乙酰半胱氨酸(100 mg/kg)，連續(xù)28 d。Model組尾靜脈注射APAP(300 mg/kg)，每日灌服生理鹽水。Control組尾靜脈注射生理鹽水(300 mg/kg)，每日灌服等量生理鹽水[6]。

1.2.2肝重/體重比 模型建立后，稱量各組大鼠體重，記為大鼠初始體重，模型建立28 d后，稱量各組大鼠體重，記為終末體重，計算大鼠增重。處死大鼠，取肝組織稱重，計算肝重/體重比。

1.2.3HE染色 將肝組織用10%福爾馬林固定并進行石蠟包埋切片，蘇木素伊紅染色，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗 5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。并參照文獻[7]方法進行肝損傷病理評分。

1.2.4血清中ALT、AST、AKP和NO測定 按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮(NO)水平。ALT、AST在510 nm 處測OD值，AKP在520 nm處測OD值，NO在550 nm處測OD值。

1.2.5ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔置96 孔酶標板，將抗原包被過夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100 μl不同稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標儀測定。

1.2.6肝勻漿中SOD、MDA和GSH測定 按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定總超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可見分光光度計測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.3統計學分析 使用統計軟件SPSS17.0對實驗數據進行分析。對實驗數據進行正態(tài)分布分析和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。

2 結果

2.1洋薊素降低大鼠肝重/體重比 檢測各組大鼠體重和肝重結果如表1所示。Model組終末體重顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組終末體重均顯著高于Model組(P<0.05)；Model組體重增量顯著低于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組體重增量顯著高于Model組(P<0.05)；Model組肝重顯著高于Control組(P<0.05)。Model組肝重/體重比顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組肝重/體重比均顯著低于Model組(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重和肝重測定結果

2.2洋薊素改善大鼠肝組織病理損傷 HE染色檢測各組大鼠肝組織病理損傷結果如圖1所示，與Control組相比，Model組肝組織肝索紊亂，炎癥細胞浸潤，細胞空泡樣變性，病理損傷評分顯著升高(P<0.05，表2)。Cynarin 50、100、150組和N-NAC組病理損傷程度較Model組有所減輕，炎癥細胞浸潤減少，空泡樣變性減少，病理損傷評分顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠肝組織損傷病理評分

圖1 HE染色

2.3洋薊素降低血清中AST、ALT、AKP、NO水平 與Control組相比，Model組血清中AST、ALT、AKP、NO水平顯著降低(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組血清中AST、ALT、AKP、NO水平均顯著低于Model組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中的各項指標測定結果

2.4洋薊素下調血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 Model組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著高于Control組(P<0.05)，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著低于Model組(P<0.05)。見表4。

表4 血清炎癥因子水平

2.5洋薊素對大鼠肝組織中SOD、GSH、MDA含量的影響 與Control組相比較，Model組SOD、GSH顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與Model組相比較，Cynarin 50、100、150組和N-NAC組SOD、GSH含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表5。

3 討論

藥物性肝損傷是指由各種處方藥或非處方藥誘發(fā)的肝損傷，包括小分子化學藥物、生物制劑、中藥、天然藥物、保健品和膳食補充劑等[8]。目前對藥物性肝損傷仍缺乏簡便、客觀、特異的診斷指標和特異的治療方法。APAP是研究最多的藥物之一，導致可預測的藥物性肝損傷，其肝毒性呈劑量依賴性[9]。到目前為止，N-NAC是治療APAP誘導的藥物性肝損傷最重要的療法。然而，如果不及時治療，患者通常需要進行肝移植[10]。已有研究證明洋薊素具有保肝活性，本文研究發(fā)現，洋薊素可降低大鼠肝組織病理損傷程度，降低大鼠肝重/體重比。

藥物性肝損傷一般表現為肝臟生化指標水平升高，血清中ALT、AST、AKP屬于藥物性肝損傷的生物標志物[11]。NO是肝細胞氧化還原生物學中至關重要的活性氮物種，在APAP中毒時，肝組織中NO的合成增加[12]。Huang等[13]研究發(fā)現金絲小棗通過降低AST，ALT和AKP水平保持肝細胞的結構完整性并減輕APAP誘導的肝損傷。尹學哲等[14]研究發(fā)現草蓯蓉不同溶劑萃取物通過降低一氧化氮合酶活性和NO水平對APAP誘導的小鼠急性肝損傷發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現，洋薊素可降低AST、ALT、AKP水平的作用。

在APAP誘導的急性肝損傷下，活化的肝巨噬細胞將釋放各種促炎細胞因子，包括TNF-α、IL6和IL-1β，這些促炎細胞因子能增強炎癥反應和增加免疫細胞，如單核細胞和中性粒細胞的流入[15]。本研究發(fā)現，洋薊素可降低TNF-α、IL6和IL-1β水平。

過量的乙酰氨基酚轉化為NAPQI后，與組織大分子共價結合并氧化脂質，導致肝毒性，而脂質過氧化會導致膜破裂，導致膜完整性喪失和微粒體酶滲漏。GSH在線粒體抗氧化防御中起關鍵作用，且NAPQI誘導的耗竭是APAP誘導的毒性中的重要事件。MDA是脂質過氧的終產物通常用作氧化應激的生物指示劑，SOD是保護活性氧反應的重要酶，在APAP誘導期間，SOD活性較低[16]。Yan等[17]研究發(fā)現膳食α-Mangostin通過增加GSH含量，降低MDA含量對APAP誘導的肝毒性具有保護作用。Liu等[18]研究發(fā)現馬齒莧乙醇提取物通過增加GSH水平、SOD活性，降低MDA含量改善對APAP誘導的肝損傷。本研究發(fā)現，洋薊素有增加SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。

綜上所述，在對APAP誘導的藥物性肝損傷中，洋薊素可改善肝組織病理損傷程度，降低肝臟生化指標水平、血清炎癥因子水平，改善氧化應激水平。本文研究結果闡明了洋薊素治療藥物性肝損傷的潛力，但具體的分子機制仍需進一步實驗研究。