芬太尼對2型糖尿病大鼠心臟的保護作用及對蛋白激酶D和內質網應激激活的調節作用①

王麗萍 季中華 任 莉 王 輝 芮海濤 曾路路 (暨南大學附屬珠海醫院麻醉科，珠海 519000)

2 型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus,T2D) 是一種以胰島素抵抗并伴有胰島 β 細胞功能缺陷所致的胰島素分泌不足而引起的以血糖水平升高、血脂異常為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病患者易發生多種心血管并發癥，包括冠心病、心肌肥厚和心力衰竭等[2]。糖尿病性心肌病是糖尿病患者死亡的主要原因，全世界流行病患者中新診斷的糖尿病性心肌病病例數逐漸上升[3]。芬太尼為阿片受體激動劑，屬強效麻醉性鎮痛藥，臨床上常用于各種疼痛及外科、婦科等手術后和手術過程中的鎮痛。研究表明芬太尼能夠影響心肌收縮功能，但其對T2D大鼠的作用尚不清楚[4]。蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)是鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin dependent protein kinase，CAMK)組的絲氨酸/蘇氨酸激酶的最新成員，參與多種細胞生物過程調節，包括細胞存活、遷移、分化和增殖[5]。已有研究證明PKD在心血管疾病的發生中起重要作用[6]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)是參與細胞凋亡內在途徑的細胞器，其應激介導的細胞凋亡是糖尿病心肌病發生發展的重要機制之一[7]。本文主要探討芬太尼對T2D大鼠心臟的作用及其及對蛋白激酶D和ER應激激活的調節作用，以期為糖尿病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠120只，體質量(190±20)g，購自四川夏派森醫藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。溫度、濕度分別控制在25℃、50%左右，大鼠在實驗前給予普通飼料適應性喂養1周。

1.1.2試劑 普通飼料和高脂高糖飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；鏈脲佐菌素(上海艾研生物科技有限公司)；RIPA裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司)；caspase-3抗體、Bcl-2抗體(碧云天生物技術研究所)；Bax抗體(上海酶聯生物科技有限公司)；PKD抗體(上海信裕生物技術有限公司)；GRP78抗體(上海優寧維生物科技有限公司)；IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiactroponin Ⅰ，cTnⅠ)和肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)ELISA試劑盒(上海聯碩生物刻科技有限公司)；FINS ELISA 試劑盒(蘇州鴻信生物技術有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(大連美輪生物技術有限公司)。

1.1.3儀器 HCC400全自動生化分析儀(山東國康生物科技有限公司)；MRBP鼠無創血壓計(上海玉研科學儀器有限公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國碧迪醫療器械有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及給藥 隨機選擇20只大鼠作為對照組，喂養正常飼料，剩余100只大鼠喂養高脂飼料。4周后喂養高脂飼料的大鼠腹腔注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素(STZ)，對照組大鼠注射等量生理鹽水。1周后測定尾靜脈空腹血糖(FBG)，大鼠血糖水平高于11.1 mmol/L即為糖尿病模型構建成功。8周后，芬太尼低、中、高劑量組大鼠分別每天注射0.5、1.0、2.0 μg/kg的芬太尼，陽性藥物對照組大鼠每天灌胃給予75 mg/kg二甲雙胍，對照組和模型組分別注射等量生理鹽水，連續2周。大鼠禁食1晚后，頸靜脈取血，麻醉后處死，摘取心臟[8,9]。

1.2.2血清FBG、TG及TC含量測定 采集血液離心，將血清置于全自動化學分析儀檢測血糖(fasting plasma glucose，FBG)、總膽固醇(total cholesterol，TG)及三酰甘油(triglycerides，TC)含量。

1.2.3大鼠HR、SBP及DBP測定 給藥最后1 d晚上，用MRBP鼠無創血壓計測量心率(heart rate，HR)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)及舒張壓(diastolicblood pressure，DBP)。

1.2.4HE染色觀察心臟損傷 將心臟組織置于4%甲醛固定后，乙醇梯度濃度脫水，石蠟包埋切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟、乙醇覆水、蘇木精染色、乙酸分化、返藍、伊紅染色后，脫水固定裝片，400倍顯微鏡下觀察。

1.2.5流式細胞術檢測心肌細胞凋亡情況 培養48 h后，胰酶消化各組心肌細胞，離心，以1×106個/ml的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl PI，置于黑暗房間孵化15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測心肌細胞中Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、PKD和GRP78蛋白表達情況 RIPA裂解液提取各組心肌細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、Cleaved caspase-3 1∶1 000、PKD 1∶500、GRP78 1∶1 000)4℃封閉過夜后，加入對應二抗室溫封閉1 h，ECL曝光。

1.2.7ELISA檢測血樣中FINS、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量和心肌細胞中cTnⅠ和CK-MB含量 按照各ELISA試劑盒說明書操作，檢測血樣中胰島素(fasting insulin，FINS)、炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量及心肌細胞中心肌損傷標記物cTnⅠ和CK-MB含量。

2 結果

2.1T2D大鼠模型構建成功 如表1所示，對照組大鼠造模前后24 h血糖含量變化無統計學意義，模型組大鼠造模24 h后血糖含量顯著高于造模前(P<0.01)，表明100只大鼠T2D模型構建成功。

表1 各組大鼠造模前后 24 h血糖含量

2.2芬太尼改善T2D大鼠糖脂代謝 與對照組相比，模型組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量明顯升高(P<0.01)，表明T2D大鼠出現糖脂代謝異常；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量變化無統計學意義，中劑量組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量明顯降低(P<0.05)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量顯著降低(P<0.01)，說明芬太尼同二甲雙胍都能夠改善T2D大鼠的糖脂代謝，見圖1。

圖1 各組大鼠糖脂代謝情況

2.3芬太尼改善T2D大鼠心臟功能 與對照組相比，模型組大鼠SBP和DBP變化無統計學意義，HR明顯升高(P<0.05)，表明T2D大鼠心臟功能減弱；與模型組相比，芬太尼低、中劑量組大鼠HR、SBP和DBP變化無統計學意義，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠SBP和DBP變化無統計學意義， HR明顯降低(P<0.05)，表明芬太尼同二甲雙胍都能夠改善T2D大鼠的心臟功能，見圖2。

圖2 MRBP鼠無創血壓計測量各組大鼠HR、SBP和DBP含量

2.4芬太尼減輕T2D大鼠心肌損傷 通過HE染色觀察發現，對照組大鼠心肌組織結構致密整齊，心肌纖維完整，無心肌纖維斷裂；模型組與芬太尼低劑量組大鼠心肌組織出現細胞排列嚴重紊亂，大量心肌纖維斷裂，細胞變性壞死嚴重；芬太尼中、高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌組織細胞排列紊亂程度依次減輕，心肌纖維斷裂依次減少，細胞變性壞死程度依次減輕(圖3A)。 ELISA檢測心肌細胞中心損傷標記物表達水平發現，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞中CK-MB和cTnⅠ含量明顯提高(P<0.01，圖3B)，表明T2D大鼠心肌受損；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細胞中CK-MB和cTnⅠ含量無明顯變化，中劑量組大鼠心肌細胞中CK-MB和cTnⅠ含量明顯降低(P<0.05，圖3B)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細胞中CK-MB和cTnⅠ含量顯著降低(P<0.01，圖3B)，表明芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌損傷。流式細胞術檢測心肌細胞凋亡發現，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.01，圖3C)，表明T2D誘導大鼠心肌細胞凋亡；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細胞凋亡率變化差異無統計學意義，中劑量組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05，圖3C)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.01，圖3C)，表明芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌細胞凋亡。Western blot檢測心肌細胞中Bax、 Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達水平可知，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調(P<0.01，圖3D)，提示T2D大鼠誘導心肌細胞凋亡；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達變化差異無統計學意義，中劑量組大鼠心肌細胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達明顯降低(P<0.05，圖3D)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.01，圖3D)，提示芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌細胞凋亡。

圖3 各組大鼠心肌損傷情況

2.5芬太尼減輕T2D大鼠炎癥反應 ELISA檢測血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量明顯升高(P<0.01)，表明T2D引起大鼠炎癥反應；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量變化差異無統計學意義，中劑量組大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量明顯降低(P<0.05)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，表明芬太尼同二甲雙胍均可減輕T2D大鼠的炎癥反應，見圖4。

圖4 ELISA檢測血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β的含量

2.6芬太尼抑制T2D大鼠PKD和內質網應激激活 Western blot檢測各組大鼠心肌細胞中PKD和GRP78蛋白表達情況發現，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達明顯上調(P<0.01)，提示T2D大鼠誘導心肌細胞PKD和內質網應激激活；與模型組相比，芬太尼低劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達無明顯變化，芬太尼中劑量組大鼠心肌細胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達明顯降低(P<0.05)，高劑量組大鼠心肌細胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達顯著降低(P<0.01)，提示芬太尼抑制T2D大鼠蛋白激酶D和內質網應激激活，見圖5。

圖5 Western blot檢測各組大鼠心肌細胞中PKD和GRP78蛋白表達

3 討論

T2D是糖尿病流行的主要類型，其主要特征是高血糖，高脂血癥和胰島素抵抗[10]。本研究通過高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素注射建立T2D大鼠模型。糖尿病組中大鼠表現出嚴重的代謝異常，包括FBG、TG、TC及胰島素水平升高，并發現芬太尼可明顯降低T2D大鼠血液中FBG、TG、TC及胰島素水平，改善T2D引起的大鼠糖脂代謝異常。

芬太尼又名1-苯乙基-4-(N-丙酰苯胺)哌啶，為一種高選擇性與μ-阿片受體結合的阿片類強效鎮痛藥。已有研究表明芬太尼能夠影響心肌收縮功能，而糖尿病性心肌病是T2D重要的并發癥，也是導致糖尿病患者死亡的主要原因[4，11]。另有研究指出心率是T2D患者全因死亡率的獨立預測因子[12]。本研究發現T2D大鼠心率明顯升高，而芬太尼能夠降低T2D大鼠的心率。本研究還發現T2D大鼠出現明顯的心肌損傷和心肌細胞凋亡現象，而芬太尼能夠抑制T2D大鼠的心肌損傷和心肌細胞凋亡，從而保護心臟。

T2D引起心肌損傷的過程與炎癥反應密切相關，IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β等炎性介質在其中發揮重要作用[13]。心肌損傷促使機體產生炎癥反應釋放炎癥因子，同時炎癥因子又可以加劇心肌損傷[14]。已有研究表明在糖尿病狀態下，炎癥反應發生率明顯增高，同時心肌損傷明顯加重[15]。本研究發現T2D大鼠炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量升高，表明T2D引起炎癥反應，芬太尼能夠降低T2D大鼠的IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量，表明芬太尼抑制T2D大鼠的炎癥反應。

糖尿病性心肌病的發病是一個慢性和復雜的過程，其主要歸因于細胞代謝異常和許多細胞器的缺陷，如線粒體，內質網和肌纖維膜。內質網是與細胞凋亡內在途徑的細胞器[7]。內質網應激最終會導致細胞凋亡和功能喪失。已有大量研究表明內質網應激參與糖尿病性心肌病的發病有關。糖尿病性心肌病可隨著細胞內Ca2+穩態和代謝紊亂誘導內質網應激[16]。 反之長期的內質網應激會影響多種心臟功能，包括能量代謝，胰島素抵抗和心力衰竭等[17]。GRP78是一種內質網分子伴侶蛋白，在內質網應激反應中顯著上調。 因此，GRP78通常作為反映內質網應激激活的生物標志物[18]。與先前研究一致，本團隊發現T2D大鼠心肌細胞中GRP78顯著上調，表明其在T2D激活內質網應激，而芬太尼可抑制T2D大鼠內質網應激激活。

已有證據表明，PKD是心力衰竭的中介，因此，為進一步了解芬太尼對T2D大鼠的心臟保護作用所涉及的潛在機制，研究組重點關注PKD[19]。PKC是PKD的主要上游激酶，最初認為是PKC引起的多種生物反應實際上是由PKD執行的[20]。已有研究證實糖尿病心臟的PKD活性顯著增加[8]。研究組發現T2D大鼠心肌細胞中PKD活性顯著增加，芬太尼能夠抑制T2D大鼠心肌細胞中PKD活化。

綜上所述，高劑量芬太尼能夠改善T2D大鼠的糖脂代謝，并減輕心肌損傷及心肌細胞凋亡和炎癥反應，同時抑制T2D大鼠蛋白激酶D和內質網應激激活，芬太尼有望用于臨床糖尿病治療，其具體分子機制還有待進一步研究。