骨髓潛伏態巨細胞病毒痕量反復激活誘導免疫衰老的單細胞RNA 測序技術研究進展

劉普恒,韓 輝,王宇虹

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 老年醫學科,哈爾濱 100081)

免疫衰老是老年人高發病率和高死亡率的核心機制之一。 廣泛潛伏在老年人群骨髓干細胞的人巨細胞病毒CMV,通過一個分化依賴的反復痕量激活機制,長期誘導并累積T 細胞的免疫衰老[1]。由于CMV 的痕量激活起始于骨髓干細胞,且病毒潛伏的骨髓干細胞比例很低,潛伏態CMV 的激活表達量也很低[2-3],而且這些骨髓干細胞表面不產生任何CMV 相關抗原標記物,這個痕量激活通過偶聯CD34+全能干細胞的分化[4-5],通過細胞內的傳遞幾近 “無痕” 的到達樹突狀細胞(dendric cell,DC)。 樹突細胞中痕量激活的CMV,通過一個細胞-細胞間接觸的方式進行抗原提呈,“沉默” 地誘導T 細胞發生CMV 特異性的免疫應答[6]。 雖然這種應答不能有效地清除CMV 潛伏庫,但是骨髓內的CMV 在普通人群中(無免疫缺陷) 啟動大量激活而產生急性CMV 病。 通過潛伏態病毒和宿主的痕量反復互作,純真(na?ve)T 細胞的多樣性逐漸耗竭,“無效” 記憶效應T 細胞克隆擴增大量累積,伴隨每次痕量＄應答產生的低水平炎性因子,構成了一個漫長的免疫衰老的核心進程[6-8]。 由于該過程隱蔽,痕量,反復,病毒-宿主互作,CMV 誘導免疫衰老的分子調控機制,一直是全球公認的難題。 伴隨單細胞RNA 測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 技術的發展, 免疫衰老的CMV 誘導調控機制正逐漸被揭示。

1 骨髓潛伏態巨細胞病毒反復痕量的激活誘導外周血T 細胞免疫衰老的概述

全世界絕大部分人會在不知不覺中攜帶感染人巨細胞病毒,老年人群的攜帶率接近100%。 人巨細胞病毒(HCMV) 是一個擁有巨大DNA 基因組的皰疹病毒,它初次感染后,即在骨髓干細胞(稱為允許細胞/ Permissive cell) 中建立終生潛伏感染。潛伏態CMV 能通過一個痕量反復激活的機制,誘導宿主發生反復痕量的免疫應答,累積形成免疫衰老,其主要累及T 細胞的適應性免疫衰老。 免疫衰老是老年人高發病率和高死亡率的核心機制之一。傳統定義的病毒潛伏期,是在不產生子代病毒的情況下維持病毒基因組,但具有為隨后的幾輪復制而重新激活的能力。 在潛伏期中,病毒僅轉錄有限數量的病毒RNA,蛋白質和microRNA。 人類巨細胞病毒(HCMV)潛伏在骨髓干細胞中,具有干細胞分化依賴的基因累積表達特點,它的潛伏期激活機制,更為復雜[9]。 在普通人群中,CMV 的痕量反復激活能夠誘導宿主產生免疫應答,但是宿主無法識別清除病毒潛伏庫,這種痕量激活也不能導致宿主發生急性疾病。 這種 “病毒―宿主” 之間存在的百萬年共進化, 產生了復雜的共生( Co-pathogen)機制。

CMV 在骨髓的痕量機會, 伴隨全能干細胞(CD34+CD14-)分化為單核系前驅/ 祖細胞(CD34+CD14+),并且繼續分化為單核/ 樹突細胞( CD34-CD14+)[9-10]的過程[5,11]。 大型DNA 病毒CMV 就是通過這種近乎完美的免疫逃避機制[12],將病毒從潛伏庫干細胞,傳遞至到抗原提呈DC 細胞/ 單核細胞中。 而且,骨髓干細胞中的CMV 潛伏細胞比例很低,應用PCR 結合原位雜交技術,預測其潛伏細胞陽性率約為1 ∶10000 ～25000,每個潛伏感染細胞的CMV 拷貝數為2 ～13 個基因組[13]。 即使應用基于單細胞的高敏感數字PCR,能提高人群的的陽性率,使接近一半的HCMV 潛伏攜帶的骨髓干細胞中檢測到病毒基因組,但是細胞基因組的檢測陽性率,也少于10 / 10000 個細胞[14]。 此外,通過檢測外周血中極少量干細胞來源的CD14+CMV 潛伏細胞中的CMV 基因載量,并未發現CMV 潛伏感染率的年齡相關[14],這提示潛伏態CMV 的痕量激活量,是一個與宿主免疫功能息息相關的互作機制。 目前的研究結果顯示,潛伏態CMV 在分化偶聯的痕量激活過程中,未檢測到足夠量的病毒轉錄本和蛋白表達(無法通過普通PCR 或者Western blot 檢測到),也未檢測到細胞表面表達的病毒特征性蛋白(無法通過流式細胞術檢測),這為潛伏態CMV 痕量反復激活誘導免疫衰老的機制,提出了嚴峻的挑戰。

2 骨髓潛伏態巨細胞病毒痕量反復激活體外實驗的單細胞研究進展

CMV 的潛伏庫建立在骨髓全能造血干細胞中,而骨髓造血干細胞是一個具有動態分化程序的異質細胞群,而且對體外刺激很敏感。 這些CD34+造血干細胞分化依賴的細胞群中,僅很小一部分攜帶CMV 轉錄本, 且始終伴隨干細胞的分化, 潛伏態HCMV 逐步發生了痕量復制和轉錄的動態變化。 由于骨髓潛伏態CMV 的病毒載量和表達水平均極低,加上攜帶CMV 基因組的骨髓細胞群具有動態變化特點,宿主的免疫功能又顯著影響 “病毒-宿主” 的互作模式,因此,應用單細胞RNA 測序進行CMV 基因表達的探索,具有突破的意義。 一個單細胞測序分析數據顯示,25 名CMV 血清陽性的造血干細胞轉錄本庫(1.5×1010序列),未能成功比對獲取CMV序列[15]。 進一步比對基因組織表達( Genotype-Tissue Expression / GTEx)數據庫,一個收集人類健康尸檢組織RNA 測序信息的數據庫,對31 個組織549 個樣本(> 4.33 ×1012核苷酸)進行CMV 序列比對,僅從40 個樣本中比對得到了潛伏期激活基因( Immediate Early / IE ) 基 因 的 序 列[15]。 體 外 對3.655 個原代感染CMV 的CD14+細胞進行經時(time-dependent)單細胞測序,分別構建宿主和病毒轉錄本庫,發現CMV 的痕量激活僅發生在一個特定表達細胞集落刺激因子的細胞亞群,這些細胞富含線粒體激活基因,細胞增殖基因,RNA 加工基因和蛋白質合成基因,且始終保持較高轉錄水平;同時,干擾素相關基因的表達下調,提示CMV 發生集落刺激和分化誘導的激活[16]。 此外,這些單細胞數據顯示CMV 從早期痕量表達狀態逐漸演進為病毒裂解和大量表達,是否存在一個演進門檻值需要深入研究[15]。 需要指出的是,體外原代感染的CD14+細胞,主要顯示骨髓干細胞分化偶聯的從痕量潛伏期過渡至大量激活期的轉錄本的后期過程,無法模擬慢性潛伏態CMV 分化偶聯的痕量激活轉錄特點[15]。 Galinato 等[16]對原代感染的7.000 個骨髓干細胞進行單細胞測序,發現大多數干細胞中檢測到了CMV 的DNA 序列,表明病毒的入侵潛伏不受限制,其激活可能受到宿主的限制。 Shnayder 等[17]分別檢測了造血干細胞(HSPC)和多系祖細胞中的CMV 轉錄本,證實CMV 轉錄僅在造血干細胞的單核細胞祖細胞中檢測得到,且與宿主抗病毒免疫應答降低有關。 這些單細胞RNA 測序數據,明確了潛伏態CMV 干細胞分化誘導的痕量激活機制。

3 巨細胞病毒激活誘導外周血免疫衰老的單細胞水平研究進展

T 細胞受體(TCR)提供的抗原特異性細胞毒性T 細胞,是宿主抗病毒的核心機制。 這些TCR 多樣性通過一個建立在基因重排基礎上的單個細胞抗原特異性受體儲備庫實現。 因此,TCR 多樣性儲備的逐漸降低,是T 細胞免疫衰老的核心機制。 巨大DNA 病毒CMV 的痕量反復激活,能誘導產生外周血最龐大的TCR 記憶效應T 細胞克隆擴增。Atsushi 等利用熒光標記的抗原肽四聚體技術,結合高識別度單細胞微矩陣,篩選人CMV 的抗原特異性TCRβ 儲備庫,獲取了外周血比例約0.05% ～8.5%的CMV-pp65 克隆擴增[18]。 檢測感染鼠巨細胞病毒(MCMV)的小鼠脾以及腸道淋巴組織中病毒特異性T 細胞,得到了MCMV 特異性記憶效應CD8+T 細胞的單細胞轉錄譜[19],這些腸道淋巴組織內的循環CD8+T 記憶細胞(TPM)克隆擴增相關基因(KLRC1,KLRK1(NKG2D),KLRG1,CX3CR1) 以及常駐記憶T 細胞( resident memory T-cells ( TRM), S1PR1,S1PR5,ITGAE,KLRG1) 相關基因存在交互表達。與循環記憶T 細胞高表達CX3CR1 而不表達KLRG1 相比,CMV 抗原激活的T 細胞克隆顯示出相對靜止( activated yet resting) 的免疫衰老相關特點,即高表達KLRG1 和CX3CR1。 通過外周血TCR的單細胞數據,進一步證實了CMV 反復痕量激活誘導T 細胞免疫衰老的特點[19]。 研究者比較了潛伏感染MCMV 的老年小鼠和無MCMV 潛伏的老年鼠針對新抗原( OVA) 的特異性CD8+T 細胞受體β(TCRβ)轉錄本,克隆擴增多樣性最廣泛的宿主,是老年MCMV 潛伏感染小鼠,這些小鼠識別新抗原肽的能力更高;老年MCMV 潛伏感染的小鼠發生了針對OVA 的強烈適應性T 細胞免疫應答,而無MCMV潛伏感染的小鼠,其TCR 多樣性明顯降低。 這些單細胞數據提示,潛伏態CMV 痕量反復激活可能對老年人群的適應性免疫發揮 “疫苗樣” 積極影響,證實了與宿主長期共進化的病毒與宿主衰老之間的復雜關系[20]。 另一個單細胞RNA 測序研究則顯示,針對新抗原入侵的高親和力TCR 在TCR 組譜(TCR repertoire)中優先擴增,這種進化依賴的親和力適應性,能被潛伏態CMV 的反復痕量激活削減[21]。 因此,為了揭示宿主共進化CMV 的終身潛伏激活,宿主TCR 多樣性和TCR 親和力,以及新抗原入侵的T細胞免疫應答之間的關系,需要更多基于單細胞RNA 測序的研究數據。 外周血人類自然殺傷(NK)細胞也在免疫衰老中也發揮重要作用,由于NK 的功能細胞表型非常復雜,通過對NK 細胞進行單細胞測序,能獲取伴有或不伴有CMV 潛伏感染的NK細胞表型差異表達譜。 CMV 的潛伏感染能顯著改變NK 細胞的功能集簇,提高適應性NK 亞群的比例,誘導CMV 適應性的NK 應答[22]。

4 針對骨髓CMV 潛伏感染調控機制的單細胞研究展望

通過單細胞的研究,研究者發現骨髓CMV 潛伏期的轉錄,其實并非休眠和沉默[1,23],越來越多的CMV 潛伏期轉錄信息通過單細胞技術的改良而獲得。 需要指出的是,普通單細胞測序平臺僅提供基因表達的 “快照”,無法動態傳達轉錄的過程,而且每個單個細胞的RNA 譜只能分析一次,因此,大部分體外原代感染的CD14+細胞內未測到CMV 的基因表達(< 0.1% HCMV 讀數)。 這個結果或提示CMV 基因組受到高度抑制,或者提示該細胞并未被感染,因為骨髓干細胞中的CMV 細胞陽性率很低。同時, CD34+干細胞的病毒轉錄水平, 顯著低于CD14+細胞,提示骨髓干細胞能抑制CMV 的激活。為了鑒別低水平CMV 轉錄本是 “ 真正的” 的零轉錄,還是初始潛伏在干細胞病毒拷貝比例低,需要動態比較CD34+干細胞與CD14+單核細胞的單細胞轉錄譜。 這種同時描繪病毒和宿主異質性的單細胞RNA 測序平臺,能夠揭示宿主細胞環境與病毒基因表達之間的功能聯系,已經用于多個 “ 宿主-病毒” 互作研究,對宿主免疫應答的復雜性和病毒的細胞允許性,提出了很多新穎的見解[16,24-30]。

需要指出的是,針對無偏見轉錄組的單細胞測序敏感度,需要細胞內轉錄≥50000 個核苷酸序列[31],很多病毒低水平激活達不到這個水平。 骨髓CMV 的痕量激活轉錄組,甚至低于1.0000 個核苷酸,這導致單細胞測序的數據稀疏( sparsity of the data), 即零讀數的占比( proportion of zero read counts)過高[32-33]。 “稀疏” 的病毒轉錄本很可能因為低豐度表達而 “ 被棄( dropouts)”[32]。 通過基于單細胞的液滴樣數字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR),理論能夠測到低于100 個核苷酸的轉錄本,從而檢測到極低水平的核苷酸拷貝數[34]。 然而,單細胞測序,無論單細胞RNA 測序,還是單細胞DDPCR,均存在固有的隨機性,需要加強樣品的質控和標準化。 基于唯一分子標識符(UMI) 技術,理論上可以消除測序深度偏差[35],但是UMI 仍然無法解決捕獲效率或細胞mRNA 含量差異的問題。

伴隨單細胞測序技術的迭代,用光反應核苷類似物(4sU) 進行核苷代謝標記(U-to-C conversion)的單細胞測序(scSLAM-seq),通過區分生化核苷代謝程度(轉錄順序的早晚),對每個細胞中數千個基因的轉錄活性(核苷生化代謝程度) 和表達差異進行同步可視化。 用scSLAM-seq 動態檢測小鼠成纖維細胞中巨細胞病毒原代感染的細胞轉錄本,能建立宿主轉錄動力學( TBP-TATA-box 相互作用和DNA 甲基化)相關的基因表達差異,通過RNA 轉錄時間(新舊程度)推斷細胞周期狀態,結合病毒感染劑量,獲取由CMV 感染誘導所致的單個細胞之間的轉錄組異質性,得到病毒相關的宿主轉錄數據,是目前針對CMV 轉錄的最全面數據[36]。 總之,單細胞測序研究平臺的發展和迭代,為揭示潛伏態CMV痕量反復激活誘導免疫衰老的復雜調控機制,展示了光明的前景。