新型冠狀病毒肺炎動物模型的研究進展

楊鈞婷,王曉堂,續國強,宋國華,2?

(1.山西醫科大學實驗動物中心,實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室,太原 030001;2.山西醫科大學附屬精神衛生醫院,太原 030001)

新型肺炎病毒感染所導致的肺炎,在全世界范圍內快速傳播,這無疑對全球公共衛生、醫療體系以及經濟發展帶來了巨大沖擊[1-2]。 2020 年2 月7日, 世界衛生組織( World Health Organization,WHO)將新型冠狀病毒肺炎英文名稱定為Corona Virus Disease 2019 (COVID-19)。 新型冠狀病毒肺炎,又名新冠肺炎,患者大都表現為輕型或普通型,約有14%為重癥型,5%為危重型[3],其傳染力極強,可通過飛沫或接觸傳播,具有較長的潛伏期[4],患者起初多表現為發熱、乏力及干咳等癥狀,嚴重者出現以呼吸困難為主的多種并發癥,更有甚者可直接導致死亡[5-7]。 由此可知,新型冠狀病毒感染的肺炎危害極強,闡明新型冠狀病毒的致病機制對該疾病的診斷治療及藥物研發至關重要。

目前,研究者采用全基因組序列分析發現新型冠狀病毒與急性呼吸綜合征相關的冠狀病毒(SARSr-CoV)高度相似[8]。 已有研究證實,新型冠狀病毒是具包膜的正鏈RNA 病毒,屬于β 冠狀病毒屬一員,感染人體的途徑與其他病毒感染人體的途徑相同[9],其包膜上的刺突蛋白(S 蛋白) 需要與細胞表面特異性受體血管緊張素轉化酶2(ACE2)[10]結合而啟動感染途徑。 近年來,在深入研究疾病的發病機理以及療效機理過程中,動物模型的使用是現代生物醫學研究中的一個極為重要的實驗方法和手段,有助于更高效地認識人類疾病的發生、發展規律和研究防治措施。 現如今新冠肺炎已經嚴重危害人類生命健康,使用動物模型對于研究新冠肺炎具有深遠的意義。 為了更好、 更快地揭開COVID-19 的 “神秘面紗”,急需制備出一種疾病模擬性好且可重現的動物模型用于新冠肺炎發生發展機制的研究,并以此為突破口進一步研制疫苗用于新冠肺炎的預防與治療。 因此,本文梳理了基于不同動物種類所建立的COVID-19 動物模型,意在為后新冠時代建立更合適的動物模型提供幫助。

1 嚙齒類COVID-19 動物模型

1.1 非轉基因動物模型

1.1.1 腺病毒轉導hACE2 新冠致敏小鼠

腺病毒載體因其具有宿主范圍廣、增殖效率高、無插入致突變性等優點,其被廣泛應用于體外基因轉導。 廣州醫科大學附屬第一醫院/ 呼吸疾病國家重點實驗室趙金存教授團隊[11]快速建立起首個新冠肺炎非轉基因小鼠模型,用在CMV 啟動子控制下表達hACE2 的腺病毒載體轉導小鼠的17CL-1細胞,通過非轉基因的方法使小鼠17CL-1 細胞中表達COVID-19 的受體hACE2 蛋白,突破了小鼠對于新型冠狀病毒的天然不致敏性成功構建了COVID-19 易感的Ad5-hACE2 小鼠動物模型。 研究發現,Ad5-hACE2 小鼠在接種COVID-19 毒株后表現出體重減輕、病毒于肺部的高度復制以及嚴重的肺部實變。 該動物模型有很好的重復性,克服了小鼠對感染的天然抵抗性,避免了轉基因小鼠制作過程中建模時間長,操作難度大等困難,且相比于轉基因小鼠模型有更高的病毒復制水平。 Ad5-hACE2 致敏小鼠模型可用于深入研究COVID-19 所致的細胞和組織損傷機制并應用于治療學,快速評估候選疫苗等方面。 但COVID-19 對于Ad5-hACE2 小鼠的感染是非致命的,這對于研究重度新冠肺炎有一定的局限性。

1.1.2 敘利亞金黃地鼠

大量研究證實,敘利亞金黃地鼠作為一種實驗動物可用于多種疾病的研究,是一種經典的實驗動物模型。 Chan 等[12]對敘利亞金黃地鼠進行人為感染操作—鼻腔內接種β-CoV/ 香港/ VM20001061 /2020 毒株(香港新冠肺炎確診患者體內提取)。 研究結果表明COVID-19 可以通過直接接觸或氣溶膠這兩種傳播途徑有效地從接種感染的倉鼠傳播給幼年倉鼠。 接種及自然感染的倉鼠表現出類似于人體輕度感染的癥狀,呼吸急促[13]、體重下降、活動減少、嗜睡[14];進一步研究還發現,在鼻黏膜及下呼吸道上皮細胞出現病毒復制;肺組織實變程度逐漸加深;COVID-19 抗原于肺部、腸道高水平表達;鼻黏膜嗅覺神經元數量減少,這一發現可能解釋了少數新冠肺炎患者會出現喪失嗅覺的現象。 此外,還有學者指出,新冠肺炎接種倉鼠有可能感染其密切接觸倉鼠發生在接種后早期的短時間內,且傳播率與鼻液中的傳染性病毒有關[15]。 相較于小鼠,金黃地鼠對COVID-19 的感染更加敏感,是適合于新冠肺炎研究的動物模型,尤其為COVID-19 可感染神經元細胞提供了新思路;且由于氣溶膠途徑可有效使COVID-19 在金黃地鼠中傳播,對于研究COVID-19的傳播動力學也具有重要意義;同時也可用于疫苗評價等方面。

1.2 hACE2 轉基因小鼠

小鼠作為基礎生命科學研究領域的常用物種,遺傳背景清晰,研究相對透徹,然而研究人員發現,COVID-19 病毒和SARS-CoV 相同,在自然狀態下無法與mACE2 受體結合從而使小鼠感染肺炎,由于這兩種冠狀病毒感染宿主時共用一扇“ 門”——ACE2 受體,來啟動病毒感染途徑傳播病毒,hACE2轉基因小鼠 “應運而生”。 在先前報道的文獻中,秦川教授團隊[16]通過顯微注射技術, 成功建立了hACE2 轉基因小鼠動物模型,在此模型中hACE2 蛋白可在轉基因小鼠的肺、心臟、腎以及小腸表達,與野生型小鼠相比,轉基因小鼠對于SARS 病毒更加易感,而且表現出更接近SARS 患者的病理變化。近年來隨著CRISPR/ Cas9 基因編輯技術的飛速發展,只需對小鼠進行改造,其就可為研究COVID-19所用。 研究人員利用CRISPR/ Cas9 敲入技術,將完整的hACE2 cDNA 插入mACE2 基因中,造成基因的插入失活,導致mACE2 基因無法正常表達,而插入的hACE2 基因可在mACE2 基因的啟動子調控下表達;hACE2 基因帶有IRES 位點,將tdTomato 基因插入到其下游實現共表達;將Cas9 mRNA、sgRNA 以及靶向構建體一同注射入小鼠受精卵中,可成功構建hACE2 轉基因小鼠COVID-19 動物模型,對新冠肺炎的研究具有重要的意義[17]。 hACE2 轉基因小鼠鼻腔接種COVID-19 毒株,待其感染后在肺、氣管和腦中檢測到了持續的高病毒載量,并出現了間質性肺炎,但未觀察到死亡現象。 hACE2 小鼠動物模型是很好的研究新冠肺炎的發病機制、病理特征、疫苗研發及其效力評估的 “有力工具”。 如趙榮華等[18]已成功建立起冠狀病毒肺炎寒濕疫毒襲肺小鼠病證結合模型,在該模型中各指標表現均與新冠肺炎患者臨床表現一致,適用于分析針對COVID-19藥物的作用機制以及評價藥效。 但是小鼠不咳嗽或打噴嚏,所以無法用于COVID-19 飛沫傳播途徑的研究。 此外還有研究發現,對于hACE2 轉基因小鼠進行胃腔內接種COVID-19 毒株也會引起感染并可進一步導致肺部病變,這又為研究新冠肺炎的傳播途徑打開了 “新大門”。

2 非人靈長類COVID-19 動物模型

恒河猴又稱普通獼猴,作為非人靈長類動物,該物種是世界各國參與醫學生物科學研究的重要品種[19]。 在此次的新冠肺炎研究工作中,恒河猴同樣做出了巨大的貢獻。 現如今,COVID-19 仍然在全世界范圍內進一步傳播,但至今人們尚不清楚新冠肺炎確診患者在治愈后還是否會再次被COVID-19感染。 為了探究這一問題,恒河猴COVID-19 再感染動物模型應運而生。 秦川教授團隊[20]和Chandrashekar 等[21]均成功建立了恒河猴COVID-19感染動物模型及恒河猴COVID-19 再感染動物模型。 在初次感染新冠肺炎恒河猴模型中,出現了類似于人體的輕微癥狀[22],輕度食欲下降、活動應答減少,但始終沒有觀察到發熱、體重下降、呼吸窘迫甚至死亡現象;進一步研究得知,病毒可在呼吸道高效復制[23]、引起肺部實變[24-25]。 在新冠肺炎再感染恒河猴模型中,很少或沒有再感染的恒河猴會表現出臨床癥狀,病毒載量相較于初次感染顯著減少。 由此推測,COVID-19 在初次攻擊非人靈長類動物后會觸發其體內快速免疫反應,從而保護宿主免于再次感染,但是感染引發的免疫相關性,目前還未從得知,仍需大量的研究證明自然免疫的持久性。 另外,秦川教授團隊[26]還通過氣管途徑接種COVID-19 毒株,成功建立了與年齡相關的新冠肺炎感染恒河猴動物模型, 研究發現與青年猴相比,COVID-19 病毒在老年猴中引起的間質性肺炎更嚴重,印證了臨床上新冠肺炎老年患者病死率高這一特征,對于深入研究新冠肺炎的致病性具有深遠的意義。 在新冠肺炎的研究工作中,恒河猴動物模型還可用于評估疫苗效力、研發治療方案等。 然而目前報道的非人靈長類動物模型在感染COVID-19 后只表現出輕微的臨床癥狀,因此還需進一步研究構建、開發具有嚴重新冠肺炎臨床表現的非人靈長類的動物模型。 此外,Deng 等[27]通過結膜途徑給恒河猴接種COVID-19 毒株,發現結膜同樣是新冠病毒傳播的潛在途徑,這為探究COVID-19 的傳播途徑提供了新思路。

3 其他哺乳動物COVID-19 動物模型

3.1 雪貂

已有研究表明,雪貂是適合于研究流感病毒的動物模型, 且雪貂ACE2 已被證實含有關鍵的SARS-CoV 結合殘基[28],所以使用雪貂研究新冠肺炎是合適的。 Kim 等[29]對哺乳動物雪貂進行人為感染操作—鼻腔內接種NMC-nCoV02 毒株(韓國新冠肺炎確診患者體內提取)。 確認雪貂感染新冠肺炎后,為了評估病毒的傳播方式,將其分別于同質量、同數量的幼年雪貂進行直接接觸和間接接觸。研究發現,哺乳動物雪貂在感染新冠肺炎后表現出體溫升高、偶爾咳嗽、活動量減少(類似于人體的乏力)、病毒復制等和人體類似的臨床癥狀[30-32];受感染雪貂與未感染幼年雪貂直接接觸可以有效地感染新冠肺炎;COVID-19 可以通過多種途徑的體液樣本感染幼年雪貂。 此次建立的新冠肺炎感染和傳播的雪貂動物模型對于COVID-19 具有天然易感性;感染后可表現出與人體類似的輕微臨床癥狀。但在研究新冠肺炎時仍具有局限性,該動物模型只表現輕微的臨床癥狀,并沒有出現體重減輕,甚至死亡,且肺中的病毒滴度相對較低,所以無法觀察、類比、研究新冠肺炎中度以及重度患者的臨床表征特點。 考慮到COVID-19 可以在人群中可以快速傳播、雪貂對于COVID-19 的高易感性等特點,雪貂動物模型將會是研究COVID-19 感染與快速傳播階段、評估預防性抗病毒藥物以及預防性疫苗效果的“有力武器”。

3.2 貓、犬

家貓家犬是現在大多數家庭最常飼養的寵物,與人類親密無間、同吃同住。 在新冠肺炎肆意傳播的這段時間內,研究證實了家養寵物也有感染新冠肺炎的風險。 因為貓犬體內的病毒受體ACE2 與人體中的病毒受體hACE2 有極大的相似性,所以對于COVID-19 具有易感性,但無明顯的與人體類似的臨床癥狀。 Zhang 等[33]首次報道了在自然條件下動物體內產生的針對COVID-19 的特異性中和抗體。有研究表明,在受感染貓體內可以檢測出COVID-19特異性中和抗體, 這對于新冠肺炎的血清學研究——篩選抗COVID-19 特異性抗體提供了新思路。 從預防的角度來看,對新冠肺炎確診患者的寵物進行隔離、病毒檢測等工作,這對于如何管理新冠肺炎患者的伴生寵物有很重要的意義[34]。 雖然現有研究表明,家貓家犬有參與COVID-19 傳播的風險,但仍需大量的研究工作證實COVID-19 在人與哺乳動物之間的傳播途徑。

3.3 蝙蝠腸樣有機體

蝙蝠又被稱為病毒的 “天然儲存庫”,其體內可包含各種病毒,尤其是RNA 病毒,對于人類和其他動物來說,具有巨大的安全隱患[35-36]。 Zhou 等[37]在有機化合物成功建立人體腸道器官的基礎之上,建立起一種基于成體干細胞的蝙蝠腸上皮器官培養方法—可成功模擬由蝙蝠腸上皮細胞組成的蝙蝠腸道。 現有新冠肺炎患者病例顯示,COVID-19 感染也會在人體內出現腸道受累的現象[38-39]。 研究人員用腸道接種(樣本來自于香港新冠肺炎確診患者)的方法來判斷蝙蝠腸道是否對COVID-19 易感。結果顯示,蝙蝠類腸道對COVID-19 的感染高度敏感,感染后出現細胞病變效應(CPE) 以及病毒的高效復制。 雖然腸道感染的途徑尚不清楚,但仍可認為COVID-19 可通過腸道這一途徑進行傳播。 相較于Vero E6 細胞,蝙蝠腸樣有機體模型可能會更高效地分離病毒用于后續研究, 也有可能是探索COVID-19 潛在來源的 “新天地”。

4 總結

目前,研究人員已建立起多種COVID-19 動物模型,其中中國科學家做出了卓越的貢獻,為更好的研究新冠肺炎奠定了堅實的基礎。 中國醫學科學院醫學實驗動物研究所率先成功建立了轉基因小鼠模型和恒河猴模型。 鑒于應急需求和提供動物模型使用的相關要求,同時為保障疫苗有效性評價的準確性,為規范建立動物模型和指導實驗動物模型應用,制定了《 實驗動物 新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)動物模型制備技術規范》。 鑒于新冠疫情的嚴峻形勢,本著為提供臨床應急使用疫苗有效性的參考依據,科學、適用、規范地制定了疫苗保護性的動物模型制備技術規范,動物模型的制作方法參考標準內容。 據已報道文獻可知,新冠肺炎動物模型使用動物種類廣且數量多,大致分為三類,嚙齒類、靈長類和其他哺乳動物(雪貂、貓、犬、蝙蝠)。嚙齒類動物在新冠肺炎研究中應用廣泛,成為了經典的構建COVID-19 動物模型的動物種類。 其中研究人員借助CRISPR/ Cas9 基因編輯技術、腺病毒載體系統,突破了小鼠對于COVID-19 的天然抵抗性,使小鼠可對COVID-19 易感,且結果重復性較好。嚙齒類COVID-19 動物模型優點主要表現為遺傳背景清晰,大小適中,繁殖周期短;倫理問題較少。 此外,還可以表現輕微COVID-19 臨床癥狀。 但是,目前針對新冠肺炎研究的嚙齒類動物模型仍具有局限性,該動物模型不打噴嚏或咳嗽,無法研究新冠肺炎的飛沫傳播途徑;無法準確復制COVID-19 的病理機制以及模擬中度及重度新冠肺炎臨床表現。非人靈長類動物在新型冠狀病毒肺炎的研究中使用較早,其與人類進化親緣性最高,對COVID-19 天然易感,實驗結果與人類患新冠肺炎的表現較為接近,但因其飼養條件要求高、實驗操作較復雜、成本高、數量有限且存在較多的倫理問題而在新冠肺炎研究中受到限制。 其他哺乳動物COVID-19 模型自身對新冠肺炎病毒具有天然易感性[40],感染后表現出輕微癥狀,可應用于傳播途徑、疫苗評估等新冠肺炎相關的研究領域。 這三類COVID-19 動物模型在探索新冠肺炎過程中都具有重要的意義,有各自鮮明的特點,可應用于不同的研究領域,所以根據所研究的內容選擇具體種類的COVID-19 動物模型顯得至關重要。

5 展望

現如今,已構建的多種不同動物種類COVID-19動物模型可以很好的模擬輕微及中度感染新冠肺炎患者的臨床表現,但都無法模擬重度及致死新冠肺炎患者的臨床表征。 據文獻報道,重癥及危重型新冠肺炎患者病情重,病死率高[41],所以當前急需制備出重癥及危重型COVID-19 動物模型并分析其臨床特征,這對于認識COVID-19 病毒所致新型肺炎的臨床規律具有重要的意義。 雖然非人靈長類動物可以較高程度模擬人體新冠肺炎的臨床表現,但還是與人體本身有所差異,為了更加忠實地模擬人體患新冠肺炎的病理特征,接下來建立人源化免疫系統或人源化器官動物模型是非常有必要的。