“清心通脈飲”對動脈粥樣硬化兔模型相關炎癥因子的影響研究

劉學謙 曹守沛 宋耀鴻

（1.太倉市中醫醫院，江蘇太倉215400；2.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇南京210001）

動脈粥樣硬化（astherosclerosis，AS）是一種以侵犯大中型動脈血管為主的慢性疾病[1]，是很多心腦血管疾病的主要病理基礎。脂質沉積是AS病灶發展的重要環節之一[2]，AS病灶中的脂質主要來自富含膽固醇的低密度脂蛋白（LDL-C），并沉積于動脈壁，損傷動脈內皮功能，促進AS病變的發生發展[3]。隨著對AS機制研究的深入，研究者發現AS具有慢性炎癥反應特征的病理過程，炎癥反應貫穿從脂紋形成到斑塊破裂的整個動脈粥樣硬化發病的各個階段[4]。AS可歸屬于中醫學“頭痛”“眩暈”“胸痹”“脈積”“痰核”等范疇。國醫大師周仲瑛教授提出“瘀熱論”與瘀熱相搏證[5]。以往研究中，我們探究了不穩定型心絞痛的瘀熱證型[6]，并采用宋耀鴻所擬之清心通脈飲治療獲得良好的療效，其機制可能是通過降低巨噬細胞凋亡抑制AS進展[7]。本研究建立了新西蘭兔AS模型，觀察清心通脈飲對AS模型兔血清中相關炎癥因子、MAPK/NF-κB信號通路和動脈內膜的影響，進一步揭示清心通脈飲治療AS可能的機制，為臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔60只，雄性，普通級，4月齡，體重2.0～2.5 kg，由南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2012-0008。本實驗經南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（編號：ACU160808）

1.2 藥物與試劑 清心通脈飲（藥物組成：太子參10 g、麥冬10 g、生地黃10 g、丹參10 g、赤芍10 g、牛膝10 g、銀花10 g、甘松10 g），由南京中醫藥大學附屬南京中醫院制劑室制備，濃縮，每毫升含生藥2.5 g。阿托伐他汀片劑，20 mg/片（輝瑞制藥有限公司，批號：170918）。

戊巴比妥鈉（德國進口分裝，批號：922L0315）；青霉素鈉（哈藥集團有限公司，批號：20170513）；β-肌動蛋白（β-actin）、核轉錄因子kappa B p65（NF-κB p65）、調 節 蛋 白 激 酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK（美國CST公司，批號：03/2017，20170701，20161001，20161203，20161211，20160606，20160921，20160820，20160814）；兔C反應蛋白（CRP）、白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-β（IFN-β）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：4339660，4327714，20171226，0510791）。

1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（7600-020型，日本HITACHI公司；CA-1500型，日本Cysmex公司）；EnSpire酶標儀（美國PerkinElmer公司）；5417R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；HZL-X160型恒溫振蕩培養箱；TS-1000型搖床（中國海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Powerpac Basic型濕轉印系統（美國伯樂公司）；Bio-rad型蛋白電泳儀/伯樂小型垂直電泳槽（美國伯樂公司）；Mini-protean Tetra Cell型蛋白轉印槽（美國伯樂公司）；MM400混合球磨儀（德國Retsch公司）；1.5 mm×15 mm PTCA擴張導管（美國Boston Scientific公司）；0.014英寸導引導絲（美國Boston Scientific公司）；球囊擴張壓力泵（美國Cordis公司）。

2 實驗方法

2.1 股動脈球囊擴張術建立AS模型 造模白兔使用3%利多卡因麻醉，穿刺右側股動脈1.5～2 cm，沿0.014英寸導引導絲將球囊送入動脈中約15～20 cm，使用壓力泵加壓（6～8 atm）擴張球囊，抗阻力向后牽拉球囊約8～10 cm，抽空球囊30 s，再次擴張牽拉球囊，充分損傷腹主動脈內膜?？p合，碘伏擦拭創口。術后連續7 d每日予肌肉注射青霉素80萬單位，并常規碘伏清創，預防感染。飼以配方高脂飼料（膽固醇2%，豬膽鹽0.5%，豬油10%，蛋黃粉5%，丙基硫氧嘧啶0.2%，與82.3%基礎飼料混合，由南京青龍山動物繁殖場配制）。12周后，取一只實驗兔處死，截取主動脈根部至髂總動脈做病理切片，進行HE染色，觀察造模情況。動脈可見內膜變薄，內皮破壞，纖維斑塊生成，視為造模成功。

2.2 分組與給藥 將造模成功的白兔隨機分為模型組、阿托伐他汀組（2.6 mg/kg）和清心通脈飲高、中、低劑量（3.33 g/kg、6.66 g/kg、13.32 g/kg）組，每組10只。另取10只正常白兔作為正常組，予正常飼料。各組分別灌胃給予相應的藥物，正常組、模型組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續4周。

2.3 指標觀察

2.3.1 生化分析法檢測血脂 末次給藥后次日以3%戊巴比妥鈉，按照1 mL/kg麻醉動物，頸動脈采血。室溫靜置2 h，離心半徑10.27 cm，1800 r/min離心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存，用HITCHI 7600全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.3.2 HE染色觀察腹主動脈病理形態 各組白兔頸動脈采血后處死，開腹截取腹主動脈至髂動脈分叉處，生理鹽水沖洗干凈，剪取部分組織分別做病理學切片。動脈標本置于4%的多聚甲醛中固定24 h（4℃），常規取材、脫水、石蠟包埋，沿動脈每隔1 mm橫斷面切取數張4 μm厚的切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.3.3 Elisa法測定血清炎癥因子水平 按照Elisa試劑盒操作說明書檢測各組兔血清中CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平。

2.3.4 Western Blot檢測相關蛋白表達 取腹主動脈組織100 mg，加入1 mL細胞裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，4倍蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，蛋白變性。取蛋白樣品進行10%分離膠和5%濃縮膠上樣電泳，電泳結束后濕法轉膜，轉膜完畢，置于封閉液中室溫非特異性封閉2 h。加入待檢測蛋白一抗（1∶1000），4℃緩慢搖動過夜。室溫TBST洗膜后孵育二抗（1∶1000，用5%BSA稀釋），置搖床上，室溫反應2 h?？贵w結合區帶用化學發光法檢測，以β-actin作為內參進行相對定量，用Image J軟件分析灰度值。

2.4-統計學方法 所有數據用SPSS 19.0軟件分析，以（±s）表示，先使用單因素方差分析，有差異后2組之間的比較用Student’s-t test檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組白兔腹主動脈病理形態比較 見圖1。模型組動脈內膜破壞，結締組織增生，泡沫細胞形成，纖維斑塊鈣化，壞死；清心通脈飲低劑量組動脈脂質沉積，動脈內膜破壞，平滑肌細胞遷移，纖維帽形成，動脈管腔狹窄；清心通脈飲中劑量組可見脂質沉積，動脈內膜增厚；清心通脈飲高劑量組和阿托伐他汀組動脈壁規整，平滑，未見明顯脂質沉積，動脈內皮增生不明顯。

3.2 各組白兔血脂水平比較 見表1。

3.3 各組白兔血清中炎性細胞因子水平比較 見表2。

3.4 各組藥物對MAPK/NF-κB信號通路的影響 見圖2、表3。與正常組比較，模型組腹主動脈組織NF-κB p65、ERK、JNK、p38 MAPK表達無統計學差 異（P＞0.05），p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達明顯升高（P＜0.01）。清心通脈飲各劑量和阿托伐他汀均可不同程度地抑制p-NF-κB p65、p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK表達，與模型組比較具有顯著性 差 異（P＜0.01，P＜0.05），對NF-κB p65、p-ERK、JNK、p38 MAPK則無明顯調節作用。

圖1 各組白兔腹主動脈病理形態（HE染色，×200）

表1 各組白兔干預后血脂指標比較（±s） 單位：mmol/L

表1 各組白兔干預后血脂指標比較（±s） 單位：mmol/L

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數（只） T C T G H D L-C L D L-C正常組 10 1.44±0.53 0.78±0.62 0.56±0.08 0.55±0.28模型組 7 32.91±3.91## 22.01±1.92## 3.13±0.68## 27.05±1.22##阿托伐他汀組 8 18.48±2.13** 8.39±1.43** 7.51±1.38** 14.40±0.18**清心通脈飲低劑量組 7 28.23±1.74 19.01±1.14 4.45±1.07 25.28±1.15清心通脈飲中劑量組 7 25.25±3.21** 11.78±1.64** 5.10±1.61 21.45±1.08*清心通脈飲高劑量組 8 22.65±2.89** 11.24±1.58** 5.83±1.44** 11.99±1.43**

表2 各組白兔干預后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較（±s）

表2 各組白兔干預后血清CRP、IL-1、TNF-α、IFN-β水平比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與阿托伐他汀組比較，△△P＜0.01；與清心通脈飲中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數（只） C R P/（μ g/m L） I L-1/（p g/m L） T N F-α/（p g/m L） I F N-β/（p g/m L）正常組 10 7.28±0.82 155.94±6.64 83.68±6.07 370.95±20.08模型組 7 15.13±0.93## 284.51±9.91## 237.28±13.56## 705.21±36.14##阿托伐他汀組 8 9.34±0.90** 172.29±7.83** 137.02±6.71** 463.24±22.70**清心通脈飲低劑量組 7 12.93±1.41**△△ 260.34±11.88**△△☆☆ 185.76±8.23△△**☆☆ 543.57±19.28**△△清心通脈飲中劑量組 7 12.45±0.66**△△ 212.21±10.14**△△ 124.56±13.64** 538.81±34.01**△△清心通脈飲高劑量組 8 8.95±0.56**☆☆ 200.47±6.28**△△ 104.75±7.84**△△ 422.48±25.55**△△☆☆

圖2 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達

4 討論

動脈粥樣硬化的病理機制非常復雜，與多種因素有關，“炎癥學說”是現在普遍公認的一種AS病理學說[8]。動脈粥樣硬化斑塊發展決定著疾病的病變，在AS進展過程中，無論是早期脂質條紋，到明顯硬化的纖維斑塊、粥樣斑塊、不穩定斑塊，還是斑塊破裂和血栓形成等階段，始終伴有炎癥反應的存在。炎癥細胞和促炎癥因子始終貫穿于整個病變的發展過程，促進動脈粥樣硬化的進展[4]。

TNF-α、IFN-β、IL-1、CRP是常見的致炎因子，在動脈粥樣硬化的發展中發揮著重要作用[9]。TNF-α可以加劇脂質和CRP、IL-1等相關脂質的黏附，促進巨噬細胞凋亡，進一步破壞血管內膜完整性，同時TNF-α參與了動脈斑塊的形成和破裂過程，加劇心血管事件的發生[10]。干擾素（IFN）是一類可以介導多種功能的相關細胞因子家族，其功能包括抗病毒、抗腫瘤、抗增殖和免疫調節活性等。但有研究顯示，在心肌梗死患者中可發現IFN-β信號傳導的增強，通過增加IFN-β給藥，也發現缺血血管的灌注恢復減慢[11]。CRP是一個經典的致炎因子，很多研究顯示CRP可通過凝集素樣氧化低密度蛋白受體-1（LOX-1）和LDL相互作用導致動脈內皮功能障礙[12]。CRP廣泛存在于AS斑塊中，被認為是粥樣病灶不穩定的標志之一[13]。IL-1是一種多效性潛在促炎因子，現代研究也發現，采用藥理抑制或者IL-1信號傳導的遺傳性可降低AS斑塊的形成[14]。NF-κB是由Rel家族蛋白形成的同源或異源二聚體轉錄因子，在調節免疫反應、炎癥反應和細胞生長中發揮重要作用[15]。絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）包括ERK1/2、JNK、p38 MAPK，每個MAPK信號通路由至少三個組分組成。MAPK途徑被多種細胞外和細胞內刺激激活，包括肽生長因子、細胞因子、激素和各種細胞應激物，例如氧化應激和內質網應激。這些信號傳導途徑調節多種細胞活動，包括增殖、分化、存活和死亡[16]。ERK是將信號從表面受體轉導至細胞核的關鍵信號分子，主要包括ERK1和ERK2兩種亞型，其磷酸化后由細胞質轉位到細胞核內，可介導Elk-1、ATF、Ap-1、c-fos和c-Jun（JNK）等轉錄因子的活化，參與細胞形態的維持、細胞骨架的構建和細胞的增殖與分化、凋亡、脂質代謝甚至炎癥反應等多種生物學反應[17]。上游的p-ERK活化可激活p-JNK和cyclinD1促進血管平滑肌的過度增殖[18]。p38 MAPK和JNK與細胞的凋亡及炎癥反應密切相關。p38 MAPK和JNK磷酸化可激活信號通路，導致細胞凋亡，抑制p38和JNK的磷酸化可以有效抗炎，降低ICAM-1、VCAM-1的表達，抑制動脈粥樣硬化的發展[19]。

表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達比較（±s）

表3 各組白兔MAPK/NF-κB信號通路表達比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01 ；與清心通脈飲低劑量組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與清心通脈飲中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 NF-κB p65 p-NF-κB p65 ERK p-ERK JNK p-JNK p38 MAPK p-p38 MAPK正常組 1.52±0.01 0.28±0.06 0.36±0.01 0.19±0.02 0.52±0.03 0.19±0.01 0.97±0.04 0.43±0.04模型組 1.58±0.02 1.57±0.02## 0.34±0.03 0.35±0.01## 0.52±0.01 0.52±0.01## 1.03±0.02 2.06±0.02##阿托伐他汀組 1.49±0.01 0.30±0.05** 0.33±0.01 0.22±0.02** 0.51±0.01 0.20±0.01** 0.96±0.01 0.45±0.03**清心通脈飲低劑量組 1.47±0.01 0.63±0.02**△△ 0.33±0.02 0.30±0.02*△△ 0.51±0.02 0.26±0.01**△△ 1.06±0.02 1.27±0.04**△△清心通脈飲中劑量組 1.51±0.02 0.51±0.03**△△○○ 0.31±0.02 0.28±0.01**△△ 0.59±0.01 0.24±0.01**△△ 1.08±0.01 1.02±0.05**△△○○清心通脈飲高劑量組 1.47±0.01 0.40±0.02**△○○☆☆ 0.34±0.01 0.27±0.01**△ 0.52±0.02 0.23±0.01**△○ 0.92±0.02 0.79±0.03**△△○○☆☆

本研究結果表明，經清心通脈飲與阿托伐他汀干預后，AS模型白兔血脂水平和炎癥因子含量均有不同程度的降低，腹主動脈病理程度減輕，p-NF-κB p65、p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表達減少。本研究發現，造模后模型組兔LDL-C較正常組明顯升高，這可能是由于在慢性炎癥和高脂糖狀態下，HDL的結構發生改變，導致血清淀粉樣蛋白A（SAA）增多，即“高密度脂蛋白失功能”[20]。而各給藥組的HDL-C又明顯高于模型組，可能與藥物改善LDL的功能有關[21]。

綜上，清心通脈飲對AS具有良好的干預作用，其作用機制可能是通過降低血脂，抑制MAPKs/NF-κB通路活化，減少炎癥因子的表達從而減輕血管炎癥，以達到抗動脈粥樣硬化的目的。但具體機制仍需進一步深入研究，才能指導臨床合理、安全、有效用藥。