Wistar大鼠癲癇模型的多模態功能磁共振成像與病理組織學對照研究

邢桂榮，牛廣明，曲琳，謝生輝，喬鵬飛*

原發性癲癇是常見的慢性神經系統疾病，具有致殘率高、病程長及易復發等特點，嚴重影響患者的生命健康[1]。因此，研究癲癇患者腦微觀結構的病理生理學信息及其發生機制，為其診斷、預防與治療提供必要的理論依據至關重要。近年來，影像學技術逐漸被應用于癲癇疾病的檢查中，并取得一定臨床應用效果。擴散峰度成像(diffuse kurtosis imaging，DKI)是較新的MRI序列，在動物腦組織及一些臨床病變影像學研究中取得一定成果[2]。三維磁化強度預備梯度回波(3D-magnetization preparatory gradient echo，3D-MPRAGE)是臨床診斷神經系統疾病的常用手段，具有較高的時間及空間分辨率[3]。目前，鮮見有關采用包含DKI及3D-MPRAGE序列在內的多模態功能MRI應用于癲癇的文獻報道。本研究在建立大鼠癲癇模型后，對其進行多模態功能MRI及組織病理學分析，探究癲癇的發病機制及大鼠癲癇模型的多模態功能MRI與其病理組織學間的關系，旨在為臨床診斷及治療癲癇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3周齡健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量180～230 g，平均(205.23±14.18) g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2015-1106。先將大鼠置于實驗室環境中適應性喂養1周，整個實驗過程中大鼠自由飲水和進食。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 動物模型制備

適應性喂養1周后將大鼠分為正常對照組(n=30)及癲癇模型組(n=30)。癲癇模型組大鼠用于制備大鼠癲癇模型，模型建造參照文獻[4]所述方式：對大鼠進行腹腔注射6 mg/kg的KA(kainic)(10 mg/支，Sigma公司提供)，腹腔注射KA后30 min起至12 h內觀察并記錄大鼠行為，按Racine的癲癇大鼠發作時行為學變化分級標準判斷癲癇模型是否成功[5]，本研究癲癇模型組30只大鼠均建模成功。對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠MRI

1.3.1 MR成像

分別于致病后3 d、1周、3周、5周和8周取雌雄各3只進行MRI檢測，同時取相同數量的正常大鼠作為空白對照掃描。釆用Discovery 750 3.0 T超導型磁共振掃描儀(美國GE公司)，四通道相控陣老鼠射頻線圈，線圈規格為24 cm×10.5 cm×13 cm。掃描序列包括：冠狀面3D-MPRAGE、T1WI快速自旋回波(fast spin echo，FSE)、T2WI FLAIR，矢狀面T2WI FSE，冠狀面擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)、擴散張量成像(difussion tensor imaging，DTI)、DKI，體素內不相干運動成像(intravoxel incoherent motion，IVIM)序列，DKI序列采集6個b值：0、500、1000、1500、2000、2500 s/mm2，25個擴散敏感梯度方向。

1.3.2 MRI圖像處理及參數計算

采用MRIcro軟件，手動勾畫大鼠腦內感興趣區域(region of interest，ROI)并對ROI中腦灰質(gray matter，GM)和腦白質(white matter，WM)中參數值進行測量，同時參考3D-MPRAGE及大鼠常規MRI以確定解剖部位。大鼠腦內ROI設定：參照大鼠解剖圖譜及文獻中方法，設定大鼠腦內9組ROI。每個ROI測3次，ROI控制在4個體素左右。將DKI圖像數據傳輸至工作站采用Functool軟件處理數據，分別得到不同時間點各組大鼠腦部ROI區域不同部位表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)圖及DKI相關參數，包含各向異性分數(fractional anisotropy，FA)、平均擴散系數(mean diffusivity，MD)、平均擴散峰度(mean kurtosis，MK)。

1.4 癲癇KA模型大鼠腦組織學檢查

分別在各時間點的擴散模型成像技術檢查結束后，立即收集大鼠腦組織，行蘇木素-伊紅(HE)染色分析，置于顯微鏡下觀察并拍照。并隨機取海馬CA1區域5個及CA3區1個不連續高倍鏡視野，計算殘存正常神經元數量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析處理，對于連續型資料以± s表示，采用t檢驗進行組間比較。采用Pearson法進行相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠不同時期腦部MRI相關參數比較

隨著致病時間延長，正常對照組大鼠腦部FA、MD、MK無明顯差異(F=0.165、0.309、0.399，P＞0.05)；癲癇模型組大鼠腦部FA及MD逐漸降低(F=34.913、56.272，P＜0.05)，MK逐漸升高(F=41.971，P＜0.05)。在相同致病時間點，癲癇模型組大鼠腦部FA及MD均低于正常對照組，而MK高于正常對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 致病3 d后MRI觀察組大鼠腦組織

致病3 d后，癲癇模型組大鼠在MRI影像學檢查冠狀面、矢狀面T2WI序列，冠狀面T2WI-FLAIR及3D-MPRAGE圖像上均未出現明顯異常信號。見圖1。

2.3 兩組大鼠不同時期腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較

隨著致病時間的延長，正常對照大鼠腦部GM及WM區域內FA、MD及MK均無明顯變化(P＞0.05)；癲癇模型組大鼠腦部GM及WM區域內FA、MD均逐漸降低，而MK逐漸升高(P＜0.05)。見表2～6。

2.4 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關參數與致病時間間的相關性分析

癲癇模型組大鼠腦部FA、MD與致病時間呈負相關(P＜0.05)，MK與致病時間呈正相關(P＜0.05)。見表7。

表1 兩組大鼠不同時期腦部MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 1 Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

表1 兩組大鼠不同時期腦部MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 1 Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

組別 3 d 1周FA MD MK FA MD MK正常對照組 0.35±0.05 0.76±0.07 0.78±0.06 0.36±0.04 0.78±0.08 0.75±0.06癲癇模型組 0.32±0.06 0.67±0.06 0.88±0.07 0.29±0.04 0.59±0.07 1.01±0.08 t值 0.941 2.391 2.657 3.00.3431 4.378 6.908 P值 0.369 0.038 0.024 0.013 0.001 0.000

續表1 兩組大鼠不同時期腦部MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 1(Cont) Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

續表1 兩組大鼠不同時期腦部MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 1(Cont) Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

組別 3周 5周 8周FA MD MK FA MD MK FA MD MK正常對照組 0.34±0.05 0.76±0.07 0.76±0.05 0.35±0.05 0.79±0.08 0.79±0.09 0.36±0.06 0.75±0.06 0.78±0.05癲癇模型組 0.20±0.03 0.45±0.08 1.13±0.09 0.15±0.02 0.37±0.04 1.28±0.08 0.11±0.02 0.22±0.02 1.40±0.07 t值 5.881 7.143 8.803 9.097 11.502 9.968 9.682 20.527 17.654 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 兩組大鼠致病3 d腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 3 days of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表2 兩組大鼠致病3 d腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 3 days of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區域 WM區域 GM區域 WM區域 GM區域 WM區域正常對照組 0.34±0.06 0.36±0.05 0.75±0.06 0.77±0.06 0.77±0.07 0.77±0.06癲癇模型組 0.30±0.05 0.33±0.06 0.66±0.07 0.68±0.06 0.87±0.06 0.89±0.08 t值 1.255 0.941 2.391 2.598 2.657 2.939 P值 0.238 0.369 0.038 0.027 0.024 0.015

圖1 致病3 d后大鼠MRI成像圖片。A：冠狀面3D-MPRAGE；B：冠狀面FSE；C：冠狀面FLAIR T2WI；D：矢狀面FSE T2WIFig. 1 Pictures of routine MRI imaging of rats. A: 3D-MPRAGE of coronal plane; B: FSE of coronal plane; C: FLAIR T2WI of coronal plane; D: FSE T2WI of sagittal plane.

表3 兩組大鼠致病1周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 3 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 1 week of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表3 兩組大鼠致病1周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 3 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 1 week of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區域 WM區域 GM區域 WM區域 GM區域 WM區域正常對照組 0.36±0.06 0.35±0.05 0.77±0.06 0.79±0.07 0.77±0.08 0.77±0.06癲癇模型組 0.28±0.04 0.30±0.07 0.57±0.05 0.59±0.06 0.98±0.05 1.02±0.07 t值 2.717 1.424 6.273 5.314 5.453 6.642 P值 0.022 0.185 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 兩組大鼠致病3周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 4 Comparison on MRI related parameters in 3 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表4 兩組大鼠致病3周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 4 Comparison on MRI related parameters in 3 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區域 WM區域 GM區域 WM區域 GM區域 WM區域正常對照組 0.34±0.06 0.34±0.05 0.75±0.08 0.77±0.07 0.79±0.05 0.78±0.06癲癇模型組 0.18±0.05 0.22±0.06 0.43±0.08 0.46±0.06 1.11±0.06 1.15±0.07 t值 5.018 3.764 6.928 8.236 10.036 9.830 P值 0.001 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 兩組大鼠致病5周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 5 Comparison on MRI related parameters in 5 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表5 兩組大鼠致病5周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 5 Comparison on MRI related parameters in 5 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

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表6 兩組大鼠致病8周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 6 Comparison on MRI related parameters in 8 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表6 兩組大鼠致病8周腦部ROI區域不同部位MRI相關參數比較(±s，n=6)Tab. 6 Comparison on MRI related parameters in 8 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，FA、MK無單位。

FA MD MK 組別 GM區域 WM區域 GM區域 WM區域 GM區域 WM區域

表7 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關參數與致病時間間的相關性分析Tab. 7 Correlation analysis between brain MRI related parameters and pathogenic time in epilepsy model group

2.5 致病不同時間后各組大鼠殘存正常神經元數量比較

致病8周后，正常對照組大鼠腦部組織可見大量正常神經元，呈現淡粉色膠質背景(圖2A)。癲癇模型組大鼠腦部組織出現變性壞死，神經元腫脹，空泡變性，輪廓及核仁模糊，且可見淋巴細胞浸潤(圖2B～2D)。隨著致病時間延長，正常對照組大鼠殘存正常神經元數量無明顯變化(P＞0.05)，癲癇模型組大鼠殘存正常神經元數量逐漸降低(P＜0.05)。在致病相同時間點，癲癇模型組大鼠殘存正常神經元數量明顯低于正常對照組(P＜0.05)。見表8。

2.6 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關參數與殘存正常神經元數量相關性分析

圖2 致病8周后正常對照組(A)及癲癇模型組(B～D)大鼠腦部組織HE染色圖片Fig. 2 HE staining images of brain tissue in normal control group (A) and epilepsy model group (B—D) after 8 weeks of disease onset.

表8 致病不同時間后各組大鼠殘存正常神經元數量比較(±s，n=6)Tab. 8 Comparison on number of remaining normal neurons after different pathogenic time points between the two groups (±s, n=6)

表8 致病不同時間后各組大鼠殘存正常神經元數量比較(±s，n=6)Tab. 8 Comparison on number of remaining normal neurons after different pathogenic time points between the two groups (±s, n=6)

組別 3 d 1周 3周 5周 8周 F值 P值正常對照組 116.32±6.45 112.32±6.87 115.33±7.31 118.32±6.97 120.54±6.54 1.236 0.321癲癇模型組 89.36±6.21 62.33±5.96 41.25±4.75 26.33±3.48 12.32±2.65 239.033 0.000 t值 7.376 13.463 20.815 28.924 37.566 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表9 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關參數與殘存正常神經元數量相關性分析Tab. 9 Correlation between rat brain MRI related parameters and number of residual normal neurons in epilepsy model group

致病后不同時間點，癲癇模型組大鼠殘存正常神經元數量與其腦部FA及MD均呈正相關(P＜0.05)，與MK呈負相關(P＜0.05)。見表9。

3 討論

DKI作為一項新技術，是在DTI的基礎上發展起來的，能夠更加真實客觀地反映組織的微觀結構[6]。癲癇的異常信號可擴散到腦內許多細微結構中并誘導損傷，DKI可顯示這種細微結構的改變[7]。在顯示病灶的微結構信息中，其參數值對評價腦白質微結構的變化更為敏感也更具有特異性，且不依賴組織結構的空間方位、可避免圖像中混雜效應的干擾，因而在評估癲癇進程和治療中發揮著非常重要的作用[8]。3D-MPRAGE屬于T1加權快速容積MRI掃描技術，具有較高的空間分辨率和時間分辨率，偽影小，能三維顯示人腦內部精細解剖結構，對神經系統疾病(包括原發性癲癇)的診斷具有重要價值[9]。相比較于單一模式的MRI，包含DKI及3D-MPRAGE序列在內的多模態功能MRI不僅能包含DTI模型所有的影像學信息，包含FA、MD等，同時還能檢測MK。相比較于FA、MD，MK的優勢在于不依賴于組織結構的空間方位，腦部GM及WM區域均可采用MK加以判定。此外，DKI及3D-MPRAGE序列的聯合檢測可顯著提升對微小病灶及病灶細節處的成像質量，利于獲得更多的影像學信息。Chen等[10]研究也認為，相比較于單一模型MRI，多模態功能MRI在癲癇的診斷中具有更高的應用價值。

在本研究中，癲癇模型組大鼠在MRI影像學檢查冠狀面、矢狀面T2WI序列，冠狀面T2WI-FLAIR圖像上均未出現明顯異常信號。但是病理組織學檢測結果顯示，癲癇模型組腦部組織出現變性壞死，神經元腫脹，空泡變性，輪廓及核仁模糊，且可見淋巴細胞浸潤。而上述結果在多模態功能MRI的測量結果上可體現出來，癲癇模型組大鼠腦部GM及WM區域FA、MD均低于正常對照組，而MK明顯高于正常對照組，提示相比較于常規單一模式的MRI檢測，多模態功能MRI診斷癲癇準確性更高，與Dupont等[11]研究結果相符。大量學者認為采用KA誘導的大鼠癲癇模型主要是引起類似于人類顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)的病理學改變及行為特征，但本研究多模態功能MRI結果顯示，信號異常并不局限于腦部組織海馬區，在基底節等GM區域及前聯合、胼胝體等WM區也出現明顯的參數異常[12]。而其原因可能在于海馬及杏仁核是異常神經沖動的起源，當海馬及杏仁核出現異常后會向周圍發出異常神經沖動，而這種異常信號擴散于周圍結構及皮質將導致癲癇的發作，形成“點燃”效應。也就是說由于缺氧等原因造成的腦部組織損傷將導致海馬神經元的丟失及膠質增生，從而誘發癲癇，引起腦部組織海馬及周圍區域影像學參數的變化，而這可能是癲癇發生的機制之一[13]。

組織病理學結果顯示，相比較于正常對照組，大鼠神經腦部組織損傷程度隨著致病時間的延長而逐漸加重，與Wang等[14]研究結果相符。而本研究相關性研究發現，癲癇模型組大鼠殘存正常神經元數量與其腦部FA及MD均呈正相關，與MK呈負相關，提示多模態功能MRI檢測結果與癲癇大鼠組織病理學檢測結果顯著相關，而多模態功能MRI可作為臨床診斷癲癇及評估其疾病嚴重程度的影像學方法之一。Rong等[15]研究顯示，顳葉癲癇患者存在一定程度的認知功能障礙，MRI和DTI不僅能有效檢出患者腦組織的損傷部位，而且能用于評估患者腦損傷程度，與本研究結果一致。

綜上所述，癲癇的發病可能與腦部海馬及杏仁核異常神經沖動有關，采用多模態功能MRI所檢測的癲癇模型大鼠的FA、MD及MK與其腦組織病理學檢測結果顯著相關，多模態功能MRI可作為臨床診斷癲癇及評估其疾病嚴重程度的影像學方法之一。

利益沖突：無。