丁基苯酞對腦出血大鼠血管內皮生長因子、血管生成素-2蛋白表達及血管新生的影響

涂鄂文，劉秋庭，譚莉，曾艷香，陳瓊

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）引起的神經功能缺損除了血腫本身引起占位效應外，血腫周圍局部血流量降低和結構性缺血性損害進一步加重神經功能損傷[1-2]。依據神經血管單元（neurovascular unit，NVU）治療新觀點，血管新生有望成為卒中治療的新靶點。通過刺激血腫周圍局部缺血部位的血管新生，重建微血管系統，改善腦組織血氧供應，穩定血腦屏障，可發揮神經保護作用從而減輕神經功能缺損[3]。本研究通過觀察大鼠ICH后腦組織中血管內皮生長因子（vaseular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）蛋白在不同時間點的動態表達及其在不同劑量丁基苯酞干預后的變化，探討丁基苯酞對ICH大鼠可能的神經保護作用及機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與實驗試劑 健康雄性成年清潔級SD大鼠，體重210±20 g，8～12周齡，均由湖南中醫藥大學東塘動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。兔抗VEGF多克隆抗體、兔抗Ang-2多克隆抗體、兔抗鼠CD34單克隆抗體均由武漢博士德生物制劑公司提供。丁基苯酞原液由石藥集團恩必普藥業有限公司提供。

1.2 動物造模與實驗分組 參照Gary A.Rosenberg等[4]的方法制備ICH大鼠模型，大鼠經10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位，沿頭皮正中線切口，充分暴露前囟，然后定位于前囟前0.2 mm，正中線向右旁開3 mm處鉆一小孔，直徑為0.5 mm，進針約5.5 mm，用微量進樣器以10 μL/min的速度注入自體血100 μL。麻醉蘇醒后，根據Longa評分法[5]進行神經功能缺損評分，1～3分造模成功大鼠。造模成功后，將大鼠隨機分為腦出血模型組、丁基苯酞低劑量組及丁基苯酞中劑量組。假手術組于相同部位注入等量無菌0.9%氯化鈉注射液。

假手術組、腦出血模型組、丁基苯酞低劑量組及丁基苯酞中劑量組各40只大鼠，每組分為1 d、3 d、7 d、15 d 4個亞組，每個亞組10只。

1.3 分組處理 于造模成功6 h后，分別給予丁基苯酞低劑量組和中劑量組大鼠丁基苯酞10 mg/kg、25 mg/kg，溶于大豆油中，每日2次灌胃，假手術組及腦出血模型組大鼠則在相同時間用同等體積大豆油代替灌胃。分別在術后1 d、3 d、7 d、15 d通過Longa評分法評估神經功能缺損。然后處死大鼠，取腦組織，其中每亞組取5只進行VEGF和Ang-2蛋白表達、新生血管計數和血管場面積測定；另外5只7 d、15 d進行血腫體積測定（1 d、3 d做腦水含量測定觀察腦水腫）。

1.4 血管內皮生長因子和血管生成素-2蛋白測定 分別在術后1 d、3 d、7 d、15 d，取以大鼠右側蒼白球（血腫）為中心的基底節部分腦白質，在機械勻漿器中加入5倍體積量的裂解液，裂解完全，4 ℃離心收集上清液，采用BCA蛋白定量法測定裂解蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳（時間4～6 h，電壓100 V）。將電泳后的蛋白轉移至經甲醇活化的PVDF膜上，加入封閉緩沖液室溫振蕩1 h，依次孵育一抗、二抗，化學發光法曝光顯色。膠片用掃描儀將圖像輸入電腦，ImagePro-plus 6.0圖像分析軟件，β-actin蛋白作為內參照，計算VEGF和Ang-2蛋白吸光度值/內參照蛋白吸光度值的比值。

1.5 微血管計數及血管場面積測定 分別在術后1 d、3 d、7 d、15 d，取大鼠右側血腫周圍腦組織進行梯度酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片。采用免疫組化法（SP法染色，DAB顯色）觀察CD34的表達。

先在低倍鏡下尋找條索狀或圓形空洞的褐色新生血管，尋找陽性血管表達最密集處，隨機選取5個區域進行高倍鏡（×200）統計視野血管數，以條索狀或中心空洞算一條進行計數，進行微血管計數（單個內皮細胞或內皮細胞簇均算為一個血管計數，管腔＞8個紅細胞直徑或帶有較厚基層的血管不計數），取平均值，采用圖像處理系統進行圖像分析，血管場面積為所測得有效血管截面面積與統計場面積的千分比。

1.6 測量血腫體積 分別在術后7 d、15 d，將大鼠腦組織從額部至枕部均勻切成厚度約1 mm的冠狀腦片，按順序排列后拍照，將圖片掃描輸入奧申影像采集系統測量腦血腫面積，根據公式：V=T1×A1+T2×A2 ……+Tn×An（V為血腫體積，A為單個層面血腫面積，T為對應冠狀腦片的切片厚度）計算血腫體積（mm3）。

2 結果

2.1 丁基苯酞對神經功能缺損的影響 ICH模型制作成功后，除假手術組外，其他各組神經功能缺損評分均呈先升高后降低的趨勢，腦出血模型組神經功能缺損評分的高峰是在術后3 d，而丁基苯酞低劑量、中劑量組神經功能缺損的高峰在術后1 d。在術后3 d、7 d、15 d，丁基苯酞中劑量組神經功能缺損評分均低于腦出血模型組（P=0.044，P=0.010，P=0.006），丁基苯酞低劑量組術后3 d神經功能缺損評分低于腦出血模型組（P=0.047），差異有統計學意義（表1）。

2.2 丁基苯酞對VEGF蛋白表達的影響 假手術組不同時間點VEGF蛋白均極少表達，腦出血模型組及丁基苯酞組術后1 d開始VEGF蛋白表達上升，并隨出血時間延長表達逐漸增加，術后15 d達高峰；丁基苯酞低劑量組在術后7 d、15 d VEGF蛋白表達與腦出血模型組比較增加（P=0.042，P＜0.001），差異有統計學意義。而丁基苯酞中劑量組則在1 d、3 d、7 d和15 d各時間點VEGF蛋白表達與腦出血模型組比較均增加（P＜0.001，P=0.008，P=0.016，P＜0.001），差異有統計學意義（表2）。

表1 不同時間點各組大鼠Longa神經功能缺損評分（單位：分）

2.3 丁基苯酞對Ang-2蛋白表達的影響 假手術組少量表達Ang-2蛋白，腦出血模型組和丁基苯酞組從術后1 d開始Ang-2蛋白表達上調，術后15 d達高峰；與腦出血模型組相比，丁基苯酞低、中劑量組在各時間點的Ang-2蛋白表達明顯增加（均P＜0.001）；1 d、3 d、7 d和15 d丁基苯酞中劑量組Ang-2蛋白表達均明顯高于低劑量組（P=0.031，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），差異均有統計學意義（表3）。

2.4 丁基苯酞對新生血管的影響 假手術組不同時間點新生血管計數極少，腦出血模型組和丁基苯酞組新生血管計數均明顯增加，并隨出血時間延長表達逐漸增加，于15 d達高峰；與腦出血模型組相比，丁基苯酞低（P=0.038，P＜0.001，P＜0.001，P=0.016）、中劑量組（均為P＜0.001）新生血管計數在1 d、3 d、7 d和15 d均增加，差異有統計學意義；1 d、3 d、7 d和15 d丁基苯酞中劑量組新生血管計數均高于低劑量組（P=0.033，P=0.008，P＜0.01，P=0.019），差異有統計學意義（表4，圖1）。

2.5 丁基苯酞對血管場面積的影響 術后3 d、7 d、15 d腦出血模型組較假手術組相比血管場面積均增加（均為P＜0.001），并隨出血時間延長逐漸增大，于15 d達高峰；術后3 d、7 d、15 d丁基苯酞中劑量組與腦出血模型組比較血管場面積均增加（均為P＜0.001）；術后7 d、15 d丁基苯酞中劑量組與丁基苯酞低劑量組比較血管場面積均增加（P=0.044，P=0.031），差異有統計學意義（表5）。

2.6 丁基苯酞對血腫體積的影響 丁基苯酞低、中劑量組與腦出血模型組在術后7 d、15 d血腫體積均無明顯差異（表6）。

表2 不同時間點各組大鼠VEGF蛋白與β-actin光密度比值

表3 不同時間點各組大鼠Ang-2蛋白與β-actin蛋白光密度比值

表4 不同時間點各組大鼠新生血管計數（單位：個）

3 討論

近年來，NVU已成為卒中研究的熱點。NVU是由神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞、周細胞及細胞外基質等細胞組分構成的一種結構和功能相對獨立的多細胞復合體[7]。NVU這一概念的提出引導了治療策略從對單一神經元的保護向對神經元、微血管及支持細胞復合體的保護。血管新生是指從原有的血管上以出芽的方式形成新的血管的過程[8-10]，治療性血管新生又稱為促血管新生，是人為的誘導缺血組織周圍的血管新生和側支血管形成，在ICH中可改善NVU中的微血管系統，為損傷的神經元修復及突觸重建創造良好的微環境。因此，促進血管新生有望成為出血性卒中治療的新靶點。

圖1 不同時間點各組大鼠新生血管計數（SP法染色，×200）

VEGF是序列高度保守的二聚體糖蛋白，是血管內皮細胞特異性的有絲分裂原，是目前發現的機體內最重要的促血管生長因子。VEGF與受體VEGFR-1、VEGFR-2等結合后，激活絡氨酸激酶，導致大量鈣離子內流從而引發級聯放大反應過程，引起血管內皮細胞通透性增加及形成臨時基質、介導內皮細胞增殖、分化等一系列生物效應，促進血管生成[11]。Ang-2是血管生成素家族成員之一。當VEGF等促血管生成因子存在時，Ang-2通過抑制Ang-1促血管穩態的作用，使細胞外基底膜及管周細胞松解，并使血管內皮細胞處于對VEGF的高反應狀態，有利于血管出芽、生長，與VEGF協同作用促進內皮細胞的遷移、血管的新生，增加缺血區血管密度，重建微血管系統[12-15]。Jeremy Ben-Shoshan等[16]發現經導管主動脈瓣置換術（Transcatheter aortic valve replacement，TAVR）患者潛在血管生成轉變與VEGF和Ang-2蛋白的表達增加具有明顯相關性。Siobhan Conroy等[17]研究表明，Ang-2和VEGFA蛋白的高表達與膠質母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）的血管生成具有很強的正相關性。

表5 不同時間點各組大鼠血管場面積（單位：‰）

表6 不同時間點各組大鼠血腫體積（單位：mm3）

研究發現CD34抗原在新生血管內皮中表達遠遠大于非新生血管內皮，是最敏感的新生血管內皮標志物，CD34陽性表達是檢測早期新生血管的良好方法[18]，可作為缺血組織周圍微循環改善的依據。本研究利用CD34標記新生血管，發現腦出血模型組新生血管計數隨出血時間延長表達逐漸增加，與VEGF、Ang-2蛋白表達呈現并行關系，均在ICH后7～15 d達到高峰，與Peng Zhengrong等[19]和Rebecca Senn等[20]的研究結果相一致。進一步證明ICH后新生血管與VEGF、Ang-2蛋白表達的持續升高密切相關。其原因可能與ICH時血腫的壓迫導致局部微循環破壞，血腫及血腫周圍區缺血缺氧進而啟動了腦組織抵抗缺血和缺氧的防御性反應，使腦組織VEGF及其受體表達上調有關。

丁基苯酞（dl-3-n-butylphthalide）是由芹菜籽中提取出的有效成分左旋丁基苯酞與其合成的異構體右旋丁基苯酞兩者的混合物。目前對于丁基苯酞的研究也主要集中在缺血性腦血管病的治療方面。研究發現丁基苯酞具有重構缺血區微循環、增加缺血區腦灌注[21]、保護線粒體、抑制神經細胞凋亡[22]、清除自由基[23]、減少炎癥反應及氧化反應[24]、減輕腦水腫[25]等作用。Zhao Yujun等[26]采用Longa改良縫線閉塞法制備永久性大腦中動脈閉塞模型，發現丁基苯酞可增加VEGF的表達，緩解腦梗死小鼠的腦水腫，降低血腦屏障的通透性，改善小鼠神經功能缺損，與Tang S.C.等[27]研究結果相一致。Li Wenxin等[28]研究發現，在慢性腦低灌注大鼠模型中，經丁基苯酞治療后Ang-2、VEGF蛋白表達量在相應的時間均明顯增加。目前，丁基苯酞用于ICH的研究較少，本研究結果提示丁基苯酞干預后可以上調VEGF、Ang-2蛋白表達，增加ICH血腫周圍新生血管密度，減輕神經功能缺損。同時，通過對血腫體積的測量，初步證明丁基苯酞并未增加顱內出血的風險。

【點睛】本研究顯示丁基苯酞可以上調VEGF和Ang-2蛋白的表達，促進血腫周圍血管新生并改善腦出血大鼠的神經功能缺損。