HPLC-DAD法同時測定三黃洗劑中5種成分的含量

劉 磊，陳 婷，成旭東，孟思思，唐 樑*

(1.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院 制劑室，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫藥大學附屬南京市中醫院 藥學部，江蘇 南京 210001)

三黃洗劑是蘇州市中醫醫院的院內制劑，是根據《肘后備急方》中的黃連解毒湯為基本方加減組方而成，由大黃、生黃芩、生黃柏三味中藥組成。三黃洗劑具有清熱解毒、消腫止痛的功效，用于治療急性濕疹、膿皰瘡及抗皮膚感染。

現行的三黃洗劑質量標準檢測項目較簡單，為了更好把控不同批次制劑的質量，本研究通過高效液相色譜法測定三黃洗劑中5個成分的含量，為科學評價和有效控制其質量提供可靠依據，增強該制劑的可控性。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AG285型電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-100VDE型超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；KDC-140HR型超速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Milli-Q Synthesis 108超純水儀(美國密理博公司)。

1.2 試藥

黃芩苷(批號：Lot.No.20161110)；漢黃芩苷(批號：Lot.No.20140722)(均由國藥集團化學試劑有限公司提供)；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212)；蘆薈大黃素(批號：110795-201710)；大黃酸(批號：110757-200206)(均由中國食品藥品檢定研究院提供)；三黃洗劑(由蘇州市中醫醫院制劑室提供，批號：180829；181105；181206)；大黃(180806)，黃芩(180106)，黃柏(181010)均由蘇州市博源藥業有限公司提供；甲醇(色譜純)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫，見表1；體積流量1.0 mL/min；檢測波長265 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸對照品各適量，加甲醇配制成每1 mL分別含142.8、136.3、44.2、7.54、3.21 μg的混合對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取待測樣品適量，搖勻，精密量取2.5 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

按三黃洗劑的處方比例分別稱取大黃，生黃芩，生黃柏這三味藥材各2份，按照三黃洗劑的制備工藝分別制成不含大黃，不含生黃芩及不含生黃柏的陰性樣品，并按“2.3”項下操作方法，制得陰性樣品溶液。

3結果

3.1 專屬性考察

按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液、混合標準品和陰性對照品溶液在265 nm波長條件下的HPLC色譜圖如圖1所示。由圖1可知，供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時間有對應的色譜峰。

注：峰1：鹽酸小檗堿；峰2：黃芩苷；峰3：漢黃芩苷；峰4：蘆薈大黃素；峰5：大黃酸

注：峰1：鹽酸小檗堿；峰2：黃芩苷；峰3：漢黃芩苷；峰4：蘆薈大黃素；峰5：大黃酸

3.2 線性關系考察

取“2.2”項下對照品混合溶液，精密吸取2、4、6、8、10、12 μL進樣，按“2.1”項下色譜條件測定。以質量濃度對色譜峰面積進行線性回歸，分別繪制各對照品的標準曲線，各對照品的回歸方程、相關系數、線性范圍見表2，結果表明各成分在相應濃度范圍內線性關系良好。

表2 各成分的線性關系

3.3 精密度試驗

取“2.2”項下同一混合對照品溶液，重復進樣5次，計算鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為1.33%、1.15%、1.61%、1.30%、1.37%。結果表明儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗

取同一批次三黃洗劑(180829)，按照“2.3 供試品溶液制備”項下方法平行制備5份供試品溶液，進樣，測得鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為2.93%、2.16%、2.02%、2.01%、2.58%。結果表明方法的重復性良好。

3.5 穩定性試驗

取同一批次三黃洗劑(180829)，按照“2.3 供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12 h進樣，測得鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.10%、1.34%、0.20%及0.51%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.6 加樣回收率試驗

精密移取已知含量的6份樣品溶液各1.25 mL，分別置100 mL容量瓶中，加入適量混合對照品溶液，混勻，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，分別計算各成分的平均回收率和RSD，結果見表3。

表3加樣回收率結果 (n=6)

續表3加樣回收率結果 (n=6)

3.7 樣品測定

取3批次三黃洗劑樣品(180829，181105，181206)，分別按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，記錄峰面積，并進行計算，結果見表4。

表43批樣品含量測定結果 (n=2)

4 討論

4.1 含量測定組分的選擇

三黃洗劑是由大黃、生黃芩、生黃柏三味中藥組成的外用液體制劑，用于治療急性濕疹、膿皰瘡及抗皮膚感染。現代藥理研究證明，大黃、黃柏、黃芩均具有抗炎抗病原微生物的作用[1-3]。

大黃具多類藥效活性成分，其中以蒽醌類、蒽酮類、鞣質等報道較多。有大量文獻報道大黃中蒽醌類衍生物為其抗菌的有效成分，其中以蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸作用最好[4]。黃柏化學成分以生物堿為主，并認為是黃柏的主要藥效成分之一，其中以小檗堿含量最多[5]。現代藥理研究表明，黃芩苷具有抗多種微生物活性[6]，漢黃芩苷具有較好的抗炎作用[7]。因此，選擇鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素和大黃酸為指標評價三黃洗劑的質量更為全面合理。

4.2 流動相的選擇

本實驗中考察了甲醇-水、乙腈-水系統，結果發現甲醇-水系統干擾較少，且各個成分的分離度較好，為改善峰形，在水相中加入磷酸，結果表明甲醇-0.1%磷酸水溶液系統作為流動相時，出峰快，基線較穩定，分離度高，峰對稱且峰形理想。

4.3 檢測波長的選擇

參考文獻并結合對照品溶液紫外全波長掃描圖發現，在265 nm下，基線較為平滑且色譜峰的峰形較好，各目標成分的色譜峰可與共存組分達到較好的分離，各峰的峰高合適，故選擇265 nm作為檢測波長。

本實驗建立HPLC-DAD法同時測定三黃洗劑中鹽酸小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、蘆薈大黃素和大黃酸5種成分的分析方法，該方法提取流程少，分析快速，定量準確，為科學評價和有效控制三黃洗劑的質量提供可靠依據。