阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對內皮細胞氧化損傷及炎癥因子的影響

李萬奎

目前我國心腦血管疾病的發病率逐年升高，嚴重威脅著人們的身體健康，影響了人們的生活質量。研究表明，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎，其本質是一種炎性改變［1］，內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化早期的病理變化［2］，氧化低密度脂蛋白是早期內皮細胞損傷的關鍵性因子［3］。在動脈粥樣硬化的治療中，阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣被公認為是有效的治療方案，不僅能抑制血小板聚集、調節血脂，還對炎癥因子有調節作用［4］。但在細胞水平上，阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對動脈粥樣硬化的影響，目前尚未見文獻報道。基于以上研究背景，該研究以人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）為研究對象，用氧化低密度脂蛋白誘導其損傷，建立動脈粥樣硬化模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT 法）檢測 HUVEC 增殖活力，并計算細胞存活率，檢測上清液中白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 含 量 、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）含量、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，來分析各組炎癥指標變化，為阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣治療動脈粥樣硬化疾病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1藥物試劑與動物阿司匹林標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100113-201706）；阿托伐他汀鈣標準品 （中國食品藥品檢定研究院，批號：100590-201804）。DMEM 培養基（GIBCO 公司，批號1279435）；胰蛋白酶（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號0458-25g）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號201804031250）；氧化低密度脂蛋白 （上海魯汶生物科技有限公司，批號20180104）；IL-1β試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號20180107）；IL-6試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180113）；TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180105）。清潔級健康成年 Sprague-Dawley（SD）大鼠 12只，雌雄不限，體質量 290～310 g，許可證號：SCXK（豫）2017-0001，由信陽職業技術學院實驗動物中心提供，購自河南省實驗動物中心；產后1 h以內新鮮臍帶數根，來自河南圣德醫院婦產科。

1.2方法

1.2.1 HUVEC的培養、鑒定及傳代 依據文獻方法及本人前期研究［5］，從健康足月產婦臍靜脈內提取HUVEC，并進行傳代。經Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色證實培養的細胞為內皮細胞。

1.2.2 含藥血清制備 模擬人類用藥方法及相關文獻［6］，將12只SD大鼠分為4組，每組3只，分別以不同劑量藥物灌胃：空白對照組及模型組（蒸餾水 2 ml），阿司匹林組（1 mg/ml阿司匹林溶液 2 ml），阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 （1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀鈣溶液2 ml）。均灌胃3 d，于最后一次灌胃后2 h無菌條件下收集腹主動脈血，同組血液混合，離心分離血清，經56℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置－20℃冰箱保存備用。

1.2.3 實驗分組及處理 取生長良好的3～4代傳代培養的HUVEC，接種于96孔板進行培養及干預，每組重復10個復孔。待細胞生長同步化后，將細胞分為4組，分別為空白對照組、模型組、阿司匹林組、阿司匹林+阿托伐他汀鈣組。空白對照組給予灌胃蒸餾水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培養液，模型組給予灌胃蒸餾水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培養液，阿司匹林組給予灌胃藥物（1 mg/ml阿司匹林溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培養液，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組給予灌胃藥物（1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀鈣溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培養液。各組細胞培養24 h后棄去培養基，除空白對照組外（給予DMEM培養液），各組再給予含100 mg/L氧化低密度脂蛋白培養液，培養24 h，進行相關指標檢測。實驗重復3次。

1.2.4 觀察指標 （1）MTT法測定細胞增殖活力及存活率。處理完各組HUVEC后，加入MTT（5 g/L）20 μl，繼續孵育4 h，吸去孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速震蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀490 nm測量各孔吸光值，結果以吸光度（OD）值表示。根據細胞增殖活力，計算存活率。（2）炎癥因子指標的檢測。處理完各組 HUVEC后，取出培養的細胞，吸取各組培養液，分別按IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒說明書方法測定 IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.2.5 統計學處理 所有數據用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，數據以（）表示，所有資料采用Student-t檢驗。

2 結果

2.1對增殖活力及存活率的影響各組HUVEC增殖活力及存活率測定結果見表1：與空白對照組比較，模型組OD值明顯降低（P＜0.01），存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）；與阿司匹林組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）。

2.2對炎癥因子的影響各組HUVEC炎癥因子指標測定結果見表2：與空白對照組比較，模型組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯增高 （P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α 含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯降低 （P＜0.01）；與阿司匹林組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組IL-6含量降低（P＜0.05），IL-1β 含量、TNF-α 含量明顯降低（P＜0.01）。

表1 阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對氧化低密度脂蛋白誘導損傷的HUVEC增殖活力及存活率的影響（，n=10）

表1 阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對氧化低密度脂蛋白誘導損傷的HUVEC增殖活力及存活率的影響（，n=10）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01；與模型組相比較，＊P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.01。

組別 OD值 存活率（%）空白對照組 0.377±0.024 -模型組 0.199±0.013# 52.79#阿司匹林組 0.250±0.014＊ 66.31＊阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 0.269±0.012＊△ 71.35＊△

表2 阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對氧化低密度脂蛋白誘導損傷的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影響（pg/ml，，n=10）

表2 阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣對氧化低密度脂蛋白誘導損傷的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影響（pg/ml，，n=10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.05，★P＜0.01。

組別 IL-1β IL-6 TNF-α空白對照組 3.145±0，611 0.155±0.038 0.815±0.173模型組 12.701±1.691＊ 0.679±0.103＊ 1.867±0.318＊阿司匹林組 10.703±0.809# 0.552±0.085# 1.584±0.172#阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 8.661±1.335▲★ 0.454±0.084▲△ 1.091±0.231▲★

3 討論

動脈粥樣硬化專家Ross［7］明確提出“動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”，指出動脈粥樣硬化是具有慢性炎癥反應特征（變質、滲出、增生）的病理過程，其發展始終伴隨炎癥反應，這一學說最終得到確立。隨著對動脈粥樣硬化發生、發展研究的深入，越來越多的證據表明動脈粥樣硬化與炎性反應密切相關。陳彩霞等［8］對健康對照者30例及Ⅰ～Ⅲ級頸動脈斑塊各30例患者血清C-反應蛋白、TNF-α、IL-6水平進行對照比較，發現血清C-反應蛋白、TNF-α、IL-6水平與頸動脈粥樣硬化斑塊嚴重程度具有密切相關性。阿司匹林是治療心腦血管疾病的一線藥物，除了抑制血小板聚集外，還具有抗炎作用。阿托伐他汀鈣為他汀類調脂藥物，同樣也具有抗炎作用。大量研究發現［9-11］，阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣能夠有效地降低腦梗死、冠心病、頸動脈粥樣硬化患者血清炎癥因子水平，抑制炎癥反應，對預防腦梗死、冠心病、動脈粥樣硬化有積極作用。

眾所周知，血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化早期的關鍵環節，也是多種血管疾病發病和治療的靶細胞［12］。 研究表明［13，14］，氧化低密度脂蛋白是最重要的損傷啟動因子，可誘導內皮細胞發生炎癥反應，使其分泌的炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等升高，從而造成內皮細胞的損傷。MTT法是檢測細胞損傷程度的常用方法，通過在490 nm測定其吸光度，從而反映細胞的增殖活力，并可計算細胞成活率［15］。IL-1β 主要由巨噬細胞、血管內皮細胞等分泌，當機體受到外來刺激時，IL-1β分泌量明顯增加，除了損傷內皮細胞結構和功能外，還可促進IL-6等炎性介質的分泌［16］。IL-6主要由血管內皮細胞、血管平滑肌細胞等分泌，可引起血管內皮細胞炎性損傷，致使血管內皮結構和功能受損［17］。TNF-α是一種重要的促炎反應的細胞因子，除了直接損傷血管內皮細胞外，還可導致內皮細胞分泌活性物質的平衡失調［18］。氧化低密度脂蛋白可誘導內皮細胞IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子分泌，在其共同作用下，導致內皮細胞結構和功能紊亂，最終誘發動脈粥樣硬化的發生、發展［19］。

該研究發現，模型組HUVEC的OD值明顯降低，存活率明顯降低，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯增高，說明氧化低密度脂蛋白明顯抑制了血管內皮細胞的增殖活力，降低存活率，激活了細胞內炎癥反應，這與肖琛等［20］研究一致。阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣組細胞OD值及存活率明顯升高，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯降低，且較阿司匹林組相比有統計學意義，說明阿司匹林聯合阿托伐他汀鈣可明顯改善氧化低密度脂蛋白誘導損傷后血管內皮細胞的增殖活力，增加存活率，抑制了炎癥反應，從而有效地保護了內皮細胞結構和功能。