Hcy及其代謝酶基因多態(tài)性與急性腔隙性腦梗死的相關(guān)性研究

邱玲玲 陳慧 徐小輝 趙江

腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）是由大腦半球或腦干深部的小的穿通動(dòng)脈閉塞引起，病灶直徑通常＜1.5cm，是常見(jiàn)的缺血性腦血管疾病，約占腦梗死的20%～30%。目前腔隙性腦梗死的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，普遍認(rèn)為該疾病是基因遺傳與環(huán)境因素（如高同型半胱氨酸血癥、高血壓等）共同作用的復(fù)雜性疾病。高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）是腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］，血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平受遺傳及環(huán)境因素（如低葉酸、低維生素B12）影響，其中基因易感性是影響Hcy 代謝的重要因素，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 是Hcy代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)其677 位點(diǎn)上等位基因C 突變?yōu)門 時(shí)，使編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，導(dǎo)致MTHFR 酶活性下降，使Hcy 水平升高［2］。由此可推測(cè)MTHFR C677T 基因有可能是腔隙性腦梗死的候選基因。本研究采用病例對(duì)照的研究方法，以臺(tái)州地區(qū)人群為研究對(duì)象，運(yùn)用PCR 及TaqMan 探針技術(shù)對(duì)MTHFR C677T 進(jìn)行基因分型檢測(cè)，明確該基因位點(diǎn)多態(tài)性與急性腔隙性腦梗死的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2018 年6 月本院神經(jīng)內(nèi)科住院患者及同期體檢中心體檢人員共278 例。急性腔隙性腦梗死146 例（觀察組），其中男87 例，女59 例；平均年齡（63.21±9.97）歲。均符合各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)［3］中的腔隙性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱MRI 的DWI 序列證實(shí)。排除腦卒中史、側(cè)腦室旁多發(fā)缺血病灶、腦白質(zhì)病變、無(wú)癥狀性腦梗死、腦出血、顱內(nèi)占位性病變；排除患有嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重肝腎功能障礙、血液病、呼吸衰竭、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等患者；排除妊娠、心臟瓣膜病、心房顫動(dòng)等。正常對(duì)照組為本院同期體檢中心健康體檢人員共132 例，其中男66 例，女66 例；平均（61.17±9.97）歲。無(wú)腦血管意外病史者，經(jīng)頭顱MRI 檢查證實(shí)顯示正常，所有受試者近3 個(gè)月均未服用過(guò)葉酸、維生素B6、維生素B12，兩組間的年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)臺(tái)州市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 研究方法 （1）基本資料收集及相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有符合對(duì)象于入院時(shí)記錄年齡、族別、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、卒中史、冠心病史、家族史及久居地等，測(cè)定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、空腹血糖（FBS）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、Hcy、葉酸等指標(biāo)。本研究中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)如下，飲酒史：≥3 次/周，平均飲白酒≥50ml/次，持續(xù)＞1年。吸煙史：幾乎每日吸煙，平均≥1 支/d，持續(xù)＞1年。高血壓：收縮壓≥140mmHg（1mmHg=O.133kPa）和（或）舒張壓≥90mmHg 或有高血壓病史并服用降壓藥者［4］。以Hcy 水平＞15μmol/L 定義為HHcy。冠心病包括有客觀證據(jù)（如心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖或冠狀動(dòng)脈造影）的心肌缺血、穩(wěn)定性心絞痛、急性冠脈綜合征、陳舊性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）及冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI）后患者。糖尿病：按照1999 年WHO 糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖≥7.0mmol/L、隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L、糖耐量試驗(yàn)2h 血糖≥11.1mmol/L 或有糖尿病病史并服用降糖藥者。血脂異常：TC ≥6.2mmol/L，HDL-C＜1.0mmol/L，LDL-C ≥4.1mmol/L，TG ≥2.3mmol/L［5］。（2）標(biāo) 本采集及DNA 提取：受試者禁食12～14h，采取肘靜脈血送本院實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)代謝指標(biāo)。同時(shí)早晨靜脈血5ml，加入EDTA 抗凝試管中，嚴(yán)格按照MTHFR C677C/T基因檢測(cè)試劑盒（深圳奧薩醫(yī)藥有限公司）說(shuō)明書的操作步驟提取基因組DNA，并置于-20℃冰箱保存。（3）引物序列：參照文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’， 下 游 引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；引物由美國(guó)ABI 公司合成。（4）基因多態(tài)性檢測(cè)：采用PCRTaqMan 探針技術(shù)檢測(cè)MTHFR C677T 基因（SNP ID：rs1801133）多態(tài)性，由浙江友萊醫(yī)療器械有限公司完成。具體如下：由美國(guó) ABI 公司設(shè)計(jì)的兩條MGB 探針，一條以VIC 熒光標(biāo)記堿基G，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)C；一條以FAM 熒光標(biāo)記堿基A，對(duì)應(yīng)樣本基因突變位點(diǎn)T。PCR 反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl21.12L，rTaq 0.8μl，引 物 探 針 0.25μl，DNA 模 板4 μl，100mM dNTP 0.16μl，dd H2O 11.67μl；反應(yīng)條件：50℃ 2min，95℃預(yù)變性2min，95℃ 15s，60℃ 1min，共45 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀上進(jìn)行。產(chǎn)物擴(kuò)增后使用Genotyping 軟件分析MTHFR C677T 基因分型數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布、方差齊性時(shí)計(jì)量資料以（）表示；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示；基因型及等位基因頻率分布差異比較采用χ2檢驗(yàn)；不同基因型間Hcy 水平比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；數(shù)量性狀位點(diǎn)分析采用單因素線性回歸；采用多因素Logistic 回歸分析影響急性腔隙性腦梗死的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料 見(jiàn)表1。

2.2 基因型和等位基因頻率分布比較 見(jiàn)表2。

表1 兩組一般臨床資料比較（）

表1 兩組一般臨床資料比較（）

組別 例數(shù) 年齡(歲) SBP(mmHg) DBP(mmHg) FBS(mmol/L) UA(μmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) 葉酸(ng/ml) Hcy(μmol/L)觀察組 146 63.21±9.97 148.09±21.05 83.21±15.45 6.39±2.26 338.75±85.75 2.57±0.79 1.20±0.26 4.44±1.03 1.49±1.37 6.83±3.72 11.15±7.1對(duì)照組 132 61.17±9.97 133.58±16.41 79.39±10.57 5.67±1.25 349.33±105.54 2.74±0.88 1.31±0.88 4.76±1.05 1.90±1.37 7.71±3.49 9.96±6.54 t值 1.702 6.003 2.118 3.290 0.892 1.644 1.382 2.541 2.948 1.812 1.319 P值 0.090 ＜0.001 0.035 0.001 0.373 0.101 0.168 0.012 0.004 0.072 0.188

表2 兩組MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布比較［n（%）］

2.3 觀察組和對(duì)照組內(nèi)MTHFR C677T 不同基因型間的Hcy 水平比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組MTHFR C677T不同基因型間的Hcy水平比較［μmol/L，（）］

表3 兩組MTHFR C677T不同基因型間的Hcy水平比較［μmol/L，（）］

注：與同組CC型比較，*P＜0.001；與同組CT型比較，#P＜0.001

組別 n CC CT TT F值 P值觀察組 146 9.77±3.56 9.40±3.14 15.77±12.00 *# 11.592 ＜0.001對(duì)照組 132 8.65±3.01 9.20±3.51 17.34±15.54*# 11.632 ＜0.001

2.4 MTHFR C677T 基因多態(tài)性與代謝指標(biāo)的數(shù)量性狀（QTL）分析 以MTHFR C677T 基因多態(tài)性作為自變量，將表1 各代謝指標(biāo)依次作為因變量，分別分析各代謝指標(biāo)與該基因多態(tài)性是否存在線性回歸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)與葉酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在線性回歸關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其它代謝指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 多因素Logistic 回歸分析 以急性腔隙性腦梗死為因變量，以MTHFR C677T 等位基因T、年齡、性別、高血壓、冠心病、糖尿病、吸煙史、飲酒史、低高密度脂蛋白血癥、高膽固醇血癥、HHcy、頸動(dòng)脈斑塊作為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中MTHFR C677T 等位基因T、高血壓、冠心病、頸動(dòng)脈斑塊者對(duì)急性腔隙性腦梗死發(fā)病有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組及對(duì)照組內(nèi)攜帶TT 型的Hcy水平均高于同組攜帶CC 型及CT 型的Hcy 水平。另外，本研究中MTHFR C677T 基因多態(tài)性與代謝指標(biāo)的數(shù)量性狀分析示MTHFR C677T 基因多態(tài)性與葉酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在線性回歸關(guān)系，提示MTHFR C677T 等位基因T（rs1801133）是與Hcy、葉酸相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)。

有關(guān)HHcy 與心腦血管疾病的相關(guān)性一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，有研究認(rèn)為HHcy 是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］，但HHcy 與腦梗死的各亞型均相關(guān)還是與某一種亞型相關(guān)，目前尚無(wú)定論。Piao X 等［7］通過(guò)薈萃分析認(rèn)為HHcy 與腔隙性腦梗死有關(guān)。本研究Logistic 回歸分析提示HHcy 對(duì)急性腔隙性腦梗死的發(fā)病影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Piao X 等的研究結(jié)果不一致，但與Zhang 等［8］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究中HHcy 與急性腔隙性腦梗死的相關(guān)性出現(xiàn)陰性結(jié)果可能原因如下：（1）腔隙性腦梗死是多基因遺傳與多環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜性疾病，目前認(rèn)為其基本病因可能是小血管動(dòng)脈硬化。高血壓病是腔隙性腦梗死的重要危險(xiǎn)因素，本文中觀察組與對(duì)照組間的基線資料提示兩組間收縮壓與舒張壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Logistic 回歸分析示高血壓病是急性腔隙性腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與上述文獻(xiàn)結(jié)論一致。HHcy 對(duì)急性腔隙性腦梗死的意義有可能被強(qiáng)效危險(xiǎn)因素（如高血壓、MTHFR C677T 等位基因T 等）間的交互作用所掩蓋；（2）Hcy的代謝受MHFR C677T 的影響較大，MHFR C677T 突變率（攜帶等位基因T）受種族、地域差異影響較大，在歐美地區(qū)突變率呈南高北低的趨勢(shì)，而在中國(guó)呈南低北高的趨勢(shì)［9］，臺(tái)州屬于低突變率地區(qū)。因此，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一致且本實(shí)驗(yàn)提示HHcy 與急性腔隙性腦梗死的發(fā)病無(wú)關(guān)有可能與選擇的受試人群有關(guān)；（3）HHcy 可能與急性腔隙性腦梗死發(fā)病無(wú)關(guān)；（4）本研究的樣本量偏少。因此未來(lái)應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確HHcy 與急性腔隙性腦梗死的相關(guān)性。

MTHFR 基因定位于1 號(hào)染色體的1p36.3 上，C677T 是該基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，其功能是催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸，參與Hcy 的再甲基化過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組和對(duì)照組間基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Logistic 回歸分析示MTHFR C677T 等位基因T 是急性腔隙性腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［OR（95%CI）=1.932（1.027，3.632），P=0.041），提示MTHFR C677T 攜帶T 等位基因者患急性腔隙性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)是非T 等位基因攜帶者的1.932 倍。本研究結(jié)果認(rèn)為，MTHFR C677T 是臺(tái)州地區(qū)急性腔隙性腦梗死的重要遺傳危險(xiǎn)因素。但對(duì)于該基因與急性腔隙性腦梗死直接相關(guān)還是通過(guò)與傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素（如高血壓、糖尿病等）的交互作用再導(dǎo)致急性腔隙性腦梗死的發(fā)生目前尚無(wú)定論，且相關(guān)研究較少。在本研究中觀察組與對(duì)照組間的收縮壓與舒張壓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Logistic回歸分析示高血壓病是急性腔隙性腦梗死的重要危險(xiǎn)因素，提示MTHFR C677T 基因多態(tài)性可能通過(guò)與高血壓的交互作用影響腔隙性腦梗死的發(fā)生。