前列腺按摩后尿沉渣AMACR檢測在前列腺癌早期診斷中的研究

李峰 馬權 陳永良 李東章 李王堅

前列腺癌是歐美男性發病率第一，病死率第二的惡性腫瘤［1］。在國內前列腺癌近年來呈快速增長趨勢［2］。目前，前列腺癌的診斷主要依靠血清前列腺特異抗原（PSA）、直腸指診以及前列腺穿刺活檢。PSA 在前列腺癌的早期診斷中起著重要作用［3］，但PSA 水平在前列腺良性疾病及增生時也會升高，導致其在早期前列腺癌的診斷中特異性與敏感性均不高［4］，尤其是PSA 在4～10 的灰區患者中，檢出率僅為25%［5］，且PSA＜10 的患者多為早期患者，前列腺癌干預效果明顯優于進展期患者［6］。α-甲酰輔酶A 消旋酶（AMACR）是一種線粒體酶，其蛋白與RNA 在前列腺癌組織中均高表達［7］，特異性接近100%，敏感性97%，是良好的診斷標記物［8］。本研究通過收集本院穿刺前列腺患者按摩后的尿液進行尿沉渣細胞中AMACR 評分的分布進行研究，探討其在前列腺癌診斷以及PSA 灰區患者中的診斷作用，旨在建立更高效的無創診斷模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015 年3 月至2017 年3月在本院行前列腺穿刺的PSA 升高患者198 例。所有研究對象均簽署知情同意書，所有患者均行經直腸B超引導下前列腺穿刺活檢術，穿刺針數為6～12 針。所有穿刺組織病理均由兩位高年資病理科醫師一致確認。本研究將患者分為兩組，穿刺陽性組85 例，穿刺陰性組113 例。198 例樣本臨床信息見表1。

表1 研究人群的臨床和病例特征［n（%）］

1.2 標本收集與處理 所有患者行前列腺檢查前由醫師行前列腺按摩。收集按摩后排尿的初始段尿液約50ml，使用HiPure Total RNA Mini Kit（Magen，China）按說明書提取尿沉渣中總RNA。使用Nanodrop 2000微量光度計測定RNA 濃度與純度。使用TransPlex? Complete Whole Transcriptom Amplification Kit（WTA2，SIGMA，USA）全轉錄組擴增試劑盒按說明書逆轉錄cDNA。

1.3 實時定量PCR 檢測尿沉渣中AMACR mRNA 和PSA mRNA 的表達 使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo QPK-201，Japan）試劑盒檢測尿沉渣中AMACR mRNA 與PSA mRNA 的表達。使用Applied Biosystem StepOnePlusTM Real-Time PCR System進行定量檢測。檢測數據由StepOne Software version v2.1（Applied Biosystem，USA）獲得。所有實驗均設置3 個重復反應。AMACR 表達量采用評分方法計算，AMAMCR 評分=AMACR mRNA/PSA mRNA×1000=2Ct（PSA）-Ct（AMACR）×1000。

1.4 統計分析 采用SPSS 21.0 與EmpowerStats 進行統計分析。分析AMACR 為非正態分布，使用兩樣本比較的秩和檢驗分析穿刺陽性與陰性患者的差異。使用spearman 檢驗AMACR 評分與臨床指標相關性。使用logistics 回歸分析建立AMACR 評分與血清PSA 的logistics 回歸模型。用受試者工作特征曲線（ROC）確定最佳臨界值、曲線下面積（AUC），對AMACR 評分、血清PSA 及兩者聯用的診斷效能進行評價。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AMACR 評分在前列腺疾病穿刺患者穿刺結果的預測作用 在全部穿刺患者中，前列腺穿刺陽性患者的AMACR 評分明顯高于前列腺穿刺陰性患者（見圖1A，P＜0.001），與血清PSA 結果相同（見圖1B，P＜0.001）。通 過Spearman 檢 驗 發 現AMACR 評 分 與tPSA、fPSA/tPSA、DRE、PSA 密度相關，與年齡、前列腺體積、Gleason 評分無關（見表2）。使用logistic回歸分析建立血清PSA、AMACR 評分以及兩者合用的診斷模型。血清PSA 在全部前列腺穿刺患者中的優勢比為5.3（95%CI：0.649～0.793，P=0.037），AMACR在全部前列腺穿刺患者中的優勢比為4.5（95%CI：0.647～0.788，P=0.036）。兩者合用模型方程為：logit（P）=-1.88692 +0.05759*PSA +0.00239*AMACR 評分。經ROC 分析，使用血清PSA，AMACR 以及兩者合用的AUC 分別為0.721、0.717 和0.798。在全部患者中AMACR 評分與血清PSA 的診斷價值無統計學差異（P=0.947），兩者合用優于血清PSA（P=0.009）或AMACR 評分（P=0.007）。由此得出，AMACR 評分在前列腺穿刺患者中有良好的預測作用，將AMACR 評分與血清PSA 聯用可以明顯提高預測總體前列腺穿刺患者穿刺結果的準確性。

圖1 AMACR評分在全部前列腺疾病穿刺患者穿刺結果的預測作用圖

表2 AMACR評分與所有患者臨床變量之間的關系

2.2 AMACR 評分在PSA“診斷灰區”的前列腺穿刺患者中的預測作用 在灰區患者中AMACR 評分與臨床指標無顯著相關性（見表3）。AMACR 評分呈非正態分布，采用兩樣本比較的Mann-Whitney 檢驗。在PSA“診斷灰區”的穿刺患者中，穿刺陽性AMACR 評分明顯高于陰性（見圖2A，P=0.004），而血清PSA 無法區分陰性與陽性患者（見圖2B，P=0.5210）。在血清PSA4-10 患者中使用logistics 回歸分析血清PSA 與AMAMCR 評分與PCa 的相關性，并建立血清PSA 和AMACR 評分的logistics 回歸模型。血清PSA 在穿刺陽性與陰性患者的優勢比為2.3（95%CI：0.407～0.683，P=0.069），AMACR 評分在前列腺穿刺陽性患者和陰性患者的優勢比為4.9（95%CI：0.576～0.820，P=0.062）。經AUC-ROC 分析，血清PSA、AMACR 評分和兩者聯用曲線下面積為0.545、0.698 和0.707。AMACR 評分診斷價值有優于血清PSA 的趨勢，但兩者相比無統計學差異（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 評分兩者聯用相比血清PSA顯示出了更高的臨床診斷價值（P=0.064）。

表3 AMACR評分與灰區患者臨床變量之間的關系

圖2 AMACR評分在PSA“診斷灰區”的前列腺穿刺患者中的預測作用圖

2.3 臨床決策曲線評估診斷模型準確性 對全體患者以及灰區患者進行臨床決策曲線評估，基本模型包含PSA、年齡、fPSA/PSA、DRE 與前列腺體積，通過比較基礎模型聯合AMACR 評分與單用基礎模型的臨床決策曲線發現，在全體患者中，基礎模型聯合AMACR評分在閾值概率＞35%時患者凈收益優于單用基礎模型，獲得最大凈收益，且能夠避免；在PSA 灰區人群中，基礎模型聯合AMACR 評分在閾值概率＞30%時優于單用基礎模型（見表4）。

表4 基本模型和基本模型聯合AMACR與所有患者相比較的凈收益在相同范圍內的不同閾值概率

3 討論

AMACR 研究多局限于腫瘤組織，其在前列腺癌組織中高表達，其敏感性高達82%～100%，特異性高達79%～100%，具有良好的組織診斷學價值［8］。但由于組織化學染色評分的主觀局限性，不能精確地對其表達量與前列腺癌關系進行研究。在組織AMACR的研究中，Al-Maghrebi 等［9］通過對前列腺組織中AMACR mRNA 水平的研究發現，AMACR RNA 的表達水平，不但能區分前列腺癌與前列腺良性疾病，同時也與腫瘤分期與Gleason 評分相關。但同時也有觀點認為，在前列腺組織中單獨使用AMACR 作為診斷標記物可能存在誤診的可能，因為其在良性腺體以及高級別上皮內瘤變（PIN）中也有表達［10］。Sroka 等［11］研究顯示，尿液中AMACR 蛋白的表達水平并不能區分前列腺良惡性疾病，其診斷能效并不優于血清PSA。Zielie 等［12］首先使用AMACR 評分的方法，收集21 例患者的按摩后尿液，對其AMACR RNA 表達量進行評分，初步顯示出AMACR 評分在西方人中的診斷價值。Ouyang 等［13］通過將尿液中AMACR RNA 與PCA3 聯合使用，提高了穿刺陰性患者的前列腺癌檢出率。本研究應用AMACR 評分的方法，評價其在中國人群中的診斷效能。

本研究通過對本院穿刺的198 例患者DRE 后的尿沉渣樣本中AMACR 評分分布進行分析后發現，AMACR 評分在總體以及“PSA 診斷灰區”患者中呈非正態分布，在全部穿刺患者中AMACR 評分診斷效能較好，AUC 為0.717，與血清PSA 相比無統計學差異（P=0.947），說明血清PSA 在前列腺癌診斷中仍有較大價值。同時，AMACR 評分與血清PSA 合用能顯著提高前列腺穿刺患者的診斷能效（AUC=0.798），優于血清PSA 與AMACR 評分單獨使用（P=0.009、P=0.007）。說明應用AMACR 評分與血清PSA 聯合診斷模型能顯著提高前列腺癌的預測準確性。

在PSA 4～10 的 灰 區 患 者 中，血 清PSA 并 不能區分前列腺良惡性腫瘤，無明顯的診斷價值（AUC=0.545）。AMACR 評分診斷價值有優于血清PSA的趨勢，但兩者相比無統計學差異（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 評分兩者聯用顯示出了更高的臨床診斷價值。這個研究結果受限于樣本量較小，有待于后續大樣本量研究進行驗證。

本研究的不足為樣本量較小，且為單中心數據，在臨床應用前還需要大規模臨床樣本進行驗證，檢測指標也僅限于AMACR 評分與PSA，在下一步的研究中，應納入更多的診斷指標，以提高該模型的診斷能效。