NSD2在t（4；14）多發性骨髓瘤中的致病機制研究進展

李佳慧 徐文琦 吳飛珍

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞腫瘤，也是第二大最常見的惡性血液腫瘤，發病率約占所有血液病的13%，占所有腫瘤的1%［1］，每年全世界約有130，000 新增MM 病例［2］。其臨床癥狀表現為漿細胞定植骨髓微環境、產生單克隆抗體，引發貧血、溶骨性骨損傷、腎功能衰竭，以及免疫缺陷等。幾乎所有的MM 患者均會經歷一個惡性前階段，即具不明意義的單克隆丙種球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）， 隨后發展為惡性前無癥狀多發性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM），最后是有癥狀的惡性MM（multiple myeloma，MM）。MM 目前仍是一種高病死率的不可治愈的惡性腫瘤。

大量對臨床患者的遺傳學研究顯示，MM 具有較高的異質性和個體間差異［3-4］，根據初步的核型分析可以將MM 分為兩類：超二倍體型（hyperdiploid MM）和非超二倍體型（non-hyperdiploid MM），前者是指患者通常含有一至多個奇數號染色體的三體現象，如3，5，7，9，11，15，19，21 號染色體，所以染色體數目會在48～75 之間變化，而后者通常是包含涉及免疫球蛋白重鏈基因位點的染色體易位［5］，后者發病率更高，約占70%，臨床顯示非超二倍體型的MM 預后更差［6］。t（4；4）型MM 是指在MM 患者中存在4 號染色體p16 區域與14 號染色體q32 區域的易位，這是MM中第二大常見的一種染色體易位變異，發病率約占所有MM 的15%～20%［7］，這種易位會導致兩個基因的過表達—FGFR3 和NSD2［8］。但臨床數據研究顯示只有70%左右的t（4；14）患者會發生FGFR3 的過表達，而所有的都會發生NSD2 的過表達［9］，說明NSD2在t（4；14）MM 病程中發揮更重要和更普遍的作用，因此研究清楚NSD2 在其中的作用機制對于t（4；14）MM 的治療具有重要意義。

1 組蛋白甲基轉移酶NSD2的結構與功能

Nuclear receptor binding SET domain 2 protein（NSD2），也叫做multiple myeloma SET domain protein（MMSET） 或 者Wolf-Hirschchorn syndrome candidate 1（WHSC1），是一個組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，屬于NSD 家族，該家族成員還包括NSD1 和NSD3［10］。NSD2 基因位于4 號染色體p16.3 區域，約120kb，包含24 個外顯子，存在兩種可變剪切轉錄本和三種蛋白亞型，Ⅰ型轉錄本編碼的NSD2 有647 個氨基酸（short-type），Ⅱ型轉錄本編碼的NSD2 有1365 個氨基酸（long-type），此外，還存在一個從NSD2 內部內含子開始轉錄產生的蛋白亞型response element Ⅱ binding protein（RE-ⅡBP），三種蛋白亞型的結構如圖1 所示，NSD2 是一個多結構域蛋白，Ⅱ型含有1 個SET甲基轉移酶活性結構域，2 個PWWP 結構域，一個HMG 結構域和4 個PHD 鋅指結構域，后三種結構域對NSD2 與其他蛋白的結合、組蛋白修飾的識別以及染色質定位有重要作用；I 型NSD2 不包含SET 催化結構域，但仍可能通過與其他蛋白的相互作用發揮染色質結構調節功能；RE-Ⅱ BP 與Ⅰ型NSD2 碳端部分重疊，不包含氮端核定位序列，可能主要在細胞質中發揮甲基轉移酶活性，甲基化非組蛋白底物。

關于NSD2 的催化底物此前的研究比較混亂，最早的研究報道稱NSD2 是H4K20 甲基轉移酶［11］，此后一系列研究又發現NSD2 還可以催化H3K4me2、H3K9me2、H3K27me3、H3K36me2、H3K36me3 和H4K20me2 等組蛋白修飾［12］，這些不一致的結果可能主要是由采用的實驗方法和材料差異導致的，比如利用合成的帶某種修飾的肽段或組裝的核小體或體內純化的核小體進行體外pull-down 實驗時，結果會有差異，最新的研究確認NSD2 主要發揮K3K36me2 甲基轉移酶活性［13］。

NSD2 在個體發育中有著重要作用，NSD2 單倍體劑量不足會導致Wolf-Hirschchorn 綜合征，臨床癥狀表現為發育遲緩、智力低下、先天性心臟病以及抗體產生缺陷等［14］。NSD2與癌癥發生也密切相關，所有（t4；14）MM 中都存在NSD2 的過表達，在胃癌、結直腸癌、肺癌、皮膚癌中也存在過表達［15］，且其過表達與膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤的預后差相關［16］，此外，有研究發現在多種兒童急性淋巴白血病細胞系中存在E1099K 的突變，該突變導致NSD2 增強的甲基轉移酶活性［17］。

圖1 不同NSD2蛋白亞型結構

2 NSD2在t（4；14）MM中的致病機制

NSD2 是一種表觀修飾酶，通過組蛋白甲基化修飾可以直接調控基因表達。NSD2 催化產生H3K36me2，H3K36me2 可調控基因表達。NSD2 可與其它組蛋白修飾酶、microRNA，以及其他蛋白相互作用。下面從四方面介紹NSD2 在MM 中的致病機制。

2.1 NSD2 催 化H3K36me2 調 控 基 因 表 達 t（4；14）MM 中NSD2 的過表達會引發全基因組水平的H3K36me2 水平的升高［18］，基因體內H3K36me2 是基因轉錄激活的一個標記，因此許多下游與細胞周期、EMT、細胞遷移以及凋亡有關的原癌基因會被上調，促進MM 的發生發展。Jonathan D. Licht 研究組2011年率先在全基因組水平研究了NSD2 過表達對MM 細胞系KMS11 基因表達的影響，發現H3K36me2 全基因組水平的升高與基因轉錄激活相關，通過比較NSD2過表達、敲低、敲除以及回補的四種不同細胞系的基因表達譜鑒定到一組NSD2 的靶基因，KEGG 富集分析發現這些基因主要與細胞死亡、細胞周期、DNA 修復以及細胞粘附有關［18］。同年Or Gozani 研究組發表的工作也發現類似現象，NSD2 通過其組蛋白甲基轉移酶活性引起KMS11 細胞系全基因組H3K26me2 水平的升高，而基因表達水平與H3K36me2 水平呈正相關，定量PCR 驗證了TGFA，PAK1，MET，RRAS2 等基因直接受NSD2 的調控，H3K36me2 水平的升高導致了原癌基因的上調［13］，因此，在KMS11 細胞系中通過shRNA 敲低NSD2 或者通過同源重組的方式敲除易位的NSD2 基因都會抑制MM 的細胞增殖，促使細胞凋亡，抑制其腫瘤生成［13，18-19］，而在無t（4；14）的MM 細胞系中過表達NSD2 后再進行荷瘤實驗可以促進其成瘤性［13，18］。此外，在前列腺癌和子宮內膜癌中都發現NSD2 會提高轉移相關基因TWIST1 基因體區域的H3K36me2 水平，促進基因轉錄，從而促進腫瘤轉移和侵襲［20］，而在t（4；14）的MM 中也存在NSD2 調控的TWIST1 的表達上調。

2.2 NSD2 與其它組蛋白修飾酶的相互作用 研究發現t（4；14）MM 細胞系中NSD2 過表達引起全基因組H3K36me2 水平升高的同時會引起H3K27me3 水平的降低，H3K27me3 是基因沉默的一個標記，雖然全基因組H3K27me3 水平的降低導致了多種基因的上調，但是特定位點的H3K27me3 水平又會升高，導致轉錄抑制，因此t（4，14）MM 細胞系對EZH2 抑制劑的處理敏感，EZH2 抑制劑可使t（4，14）MM 細胞系生長受到抑制［21-22］。Relja Popovic 研究組2004 年發表的工作發現在NSD2 表達水平低的MM 細胞系中EZH2結合水平低以及H3K27me3 比較少的位點，會在NSD2表達水平高的細胞系中出現EZH2 結合水平升高，許多在NSD2 表達水平高的細胞系中特有的EZH2 的基因組結合峰位于CTCF 位點，CTCF 位點是已知的絕緣子，NSD2 上調會在基因組上建立組蛋白修飾的邊界，導致絕緣子另一側基因EZH2 結合水平和H3K27me3水平的升高，表達受到抑制［22］。NSD2 的表達同時受到EZH2 的 調 控，miR-203，miR-26a 和miR-31 都是抑癌性microRNA，可以降低NSD2 的mRNA 的穩定性從而下調原癌基因NSD2 的表達，但EZH2 介導的H3K27me3 會抑制這類microRNA 的表達從而上調NSD2 的表達水平［23］，這也說明了NSD2 和EZH2 之間的緊密聯系。此外，NSD2 還可以與KAP1 復合物以及組蛋白去乙酰化酶結合發揮轉錄抑制作用［24-25］。

2.3 NSD2 與microRNA 的相互作用 MicroRNA 主要通過調控mRNA 的穩定性、影響靶基因的表達來發揮其生物效應，而microRNA 本身的表達又會受到表觀修飾和轉錄因子的調控。D-J Min 等研究者通過轉錄組分析鑒定到miR-126*是NSD2 的一個靶標，而miR-126*又可以靶向c-myc mRNA 的3’非翻譯區抑制其翻譯過程，染色質免疫共沉淀實驗發現NSD2 會和KAP1 以及HDAC1 共同結合在miR-126*的宿主基因啟動子區域，形成H3K9me3 標記抑制其表達，因此，外源過表達miR-126*可以顯著降低t（4；14）MM 細胞系的增殖速率［25］。此外，對正常漿細胞、MGUS 漿細胞以及MM 漿細胞的轉錄組分析鑒定到多種在MM 中異常轉錄的microRNA，如發揮抑癌作用的miR-196b、miR-135b、miR-320、miR-20a、miR-19b、miR-19a 和miR-15a 等的下調，發揮促癌作用的miR-17-92 簇、miR-221/222 簇等的上調［26］，但這些micro-RNA 的異常轉錄是否受到NSD2 的調控有待進一步驗證。

2.4 NSD2 與其他蛋白的相互作用 組蛋白修飾酶介導組蛋白的各種轉錄后修飾，可以影響染色質結構進而調節基因表達，但組蛋白修飾酶被靶向至特定基因位點或特定的基因組位置的機制尚不清楚，NSD2 亦然。因此，研究與NSD2 存在相互作用的蛋白對深入了解其功能和作用機制具有重要作用。蛋白免疫共沉淀和質譜結果顯示NSD2 與IQGAP1、TIAM1 蛋白存在相互作用［27］，這兩個蛋白可以和β-catenin 相互作用參與到WNT 信號通路，基因表達譜顯示NSD2 的敲低會顯著下調CCND1 的表達，且染色質免疫共沉淀顯示NSD2 會結合到Ccnd1 啟動子區域［28］，而CCND1又是β-catenin/Tcf4 復合物的下游靶基因，說明NSD2和β-catenin 之間可能存在相互作用共同調節其下游靶基因，而WNT/β-catenin 信號通路又在個體發育和前列腺癌中發揮重要作用，這與NSD2 異常會影響個體發育以及在前列腺癌中存在NSD2 的過表達相一致，說明了二者之間的聯系。Yang P 等研究者發現在對閹割治療有耐受的前列腺癌細胞中，NSD2 可以和NF-κB 直接相互作用共同激活其下游靶基因的表達，如IL-6、IL-8、VEGFA、BCL-2、BIRC5、c-MYC 和CCND1 等，染色質免疫共沉淀實驗也證明NSD2 和NF-κB 在這些基因位點存在共定位，NSD2 的表達又會通過NF-κB 受到細胞因子如TNF-α、IL-6 的調控，NSD2 的過表達又會反過來與NF-κB 共轉錄激活其下游靶標，因此導致NF-κB 通路的持續激活［28］，但這一蛋白相互作用以及調控環路是否在MM 中也存在有待進一步驗證。最近的一項研究發現在t（4；14）MM 細胞系KMS11 中存在NSD2 和PARP1 的相互作用，后者可以催化NSD2 發生多聚ADP 核糖基化而抑制NSD2 在染色質上的結合［29］。

3 展望

現有研究表明，NSD2 是t（4；14）型MM 發生發展的核心調控因子，研究清楚NSD2 在t（4；14）型MM 中的具體致病機制將有助于治療MM 的新藥開發。研究表明在MM 中，存在NSD2 和EZH2 的相互作用，且利用小分子抑制劑對EZH2 進行干擾確實能抑制MM 細胞的增殖，這一作用能否被發展為臨床治療有待進一步研究，一些microRNA 的過表達也可以達到抑制MM 細胞增殖的效果，但microRNA 如何給藥以及如何靶向特定類型細胞仍是個問題。此外，DNA 甲基化也是一個很重要的表觀調控機制，在NSD2 介導的全基因組H3K36me2 的變化以及基因表達譜的變化中，是否存在和DNA 甲基化的相互作用值得研究，但目前已有研究表明利用5-aza 抑制DNA 的甲基化也能起到抑制MM 細胞增殖的作用［30］，具體作用機制有待清楚闡明；最后，針對NSD2 的靶向抑制看似是最為直接的方式，所以需要進一步研究清楚NSD2 發揮其催化功能的具體方式和關鍵結構域，從而可以針對不同結構域來設計或篩選小分子抑制劑，近期的幾項研究通過高通量篩選已經鑒定到多個靶向NSD2 的小分子抑制劑，能否被應用于臨床治療未來還需要進一步的研究。