FAP和MMP-9在人乙肝相關性肝纖維化分級及肝癌中的表達意義

馬海芬 肖維華 虞繼紅 余波 蔣茂芬

肝星狀細胞（HSC）是肝纖維化發生的關鍵細胞，在肝纖維化過程中對細胞外基質（ECM）的生成與降解均有重要的意義。肝內參與ECM 降解主要是基質金屬蛋白酶類（MMPs）。MMPs 是被廣泛認為對基質重塑起重要作用的一種I 型膠原酶，在肝纖維化發生機制的研究中具有重要意義，在癌細胞侵襲轉移過程中具有重要的地位。成纖維細胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是一種間質細胞產生的跨膜絲氨酸蛋白酶，在組織重塑中發揮重要的作用，現在已經成為一個激活的成纖維細胞的特異性標記物，對腫瘤的浸潤、轉移有重要意義。目前國內對FAP 和MMPs 與纖維化的研究多集中在動物實驗及體外培養方面［1］。在人體內肝纖維化和肝癌組織中的表達意義尚未見報道。本研究擬檢測乙肝相關性肝纖維化和肝癌組織中FAP 和MMP-9 的表達水平，為肝纖維化的預防和治療提供理論基礎，并為臨床早期診斷肝癌的發生與發展提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集近3 年本院病理證實肝纖維化的肝穿刺標本42 例和肝癌手術切除標本32 例，共74 例入組，血清乙肝表面抗原陽性，除外合并HCV、HDV、HIV 等病毒感染，除外自身免疫性肝病、藥物性肝炎等其它可能導致肝實質病變的慢性疾病。肝硬化組織取自距腫瘤邊緣＞1cm。同時收集非乙肝相關性肝病組織11 例（包括5 例脂肪性肝病、2 例自身免疫性肝病和3 例原因不明的肝功能異常）和因外傷切除的臨床和病理證實為正常肝組織的病例13 例作為對照。乙肝相關性肝病患者包括男51 例，女23 例；年齡25～82 歲，中位年齡49.5 歲。炎癥分級和纖維化分期結合HE 和Masson 染色結果，按簡化的慢性肝炎的評分系統，S0：無纖維化；S1：匯管區擴大，輕度纖維化；S2：匯管區周圍纖維化或纖維分隔形成，但小葉結構保留；S3：纖維化伴小葉結構紊亂，但無明顯的肝硬化；S4：可能或肯定的肝硬化。74 例患者中S1=18，S2=23，S3=10，S4=23。所有肝癌病例均有詳細的臨床資料、手術記錄。術前未行任何抗腫瘤治療。腫瘤直徑＞3cm 者14 例，≤3cm 者18 例；組織學分級顯示高中分化20 例，低分化12 例；伴肝硬化20 例，無肝硬化12 例。實驗中23 例S4 期標本包括穿刺組織3 例和肝癌周圍肝硬化組織20 例。所有標本經2 名病理主治醫師復習。收集的臨床數據包括術前血清AFP、術前血清HBV-DNA、腫瘤大小、腫瘤數目、分化程度、脈管癌栓等數據。

1.2 主要試劑 Fibroblast activation protein（Abcam，ab207178）兔單克隆抗體（稀釋度為1：200）購自艾博抗（上海）貿易有限公司、MMP-9（56-2A4）鼠單克隆抗體（稀釋度為1：100）購自福州邁新生物技術有限公司；鼠兔通用型二抗PV6000 免疫組化試劑盒（Dako，K5007）購自Dako 公司。

1.3 方法 采用免疫組化PV-6000 二步法。活檢組織經石蠟包埋切片，石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后行免疫組化染色，抗原采用枸櫞酸緩沖液高壓鍋高溫高壓修復，余步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用免疫組化方法檢測組織中FAP 和MMP-9 的表達水平。陽性對照選用已知陽性片，陰性對照選用因外傷切除的正常組織，并用TBS 代替一抗作陰性試劑對照。

1.4 陽性結果判斷 肝纖維化組織中FAP 的陽性表達主要分布于門管區內血管壁周圍及小葉周圍纖維間隔內的成纖維細胞的胞漿中，MMP-9 的陽性表達也分布于成纖維細胞的胞漿中，與FAP 表達重疊的區域在門管區及纖維間隔中。肝癌組織中FAP 的陽性表達分布于枯否細胞、間質成纖維細胞的胞漿中，MMP-9 的陽性表達主要分布于癌細胞的胞漿中，間質細胞中有少量表達。FAP、MMP-9 染色陽性物質呈黃色、棕黃色細顆粒狀。免疫組織化學結果判定被相對量化為陽性染色間質面積和切片中選擇的整個間質區域的百分比：強陽性，＞30%間質細胞中等到強染色；弱陽性，5%～30%間質細胞中等到強染色或＞30%弱染色；陰性，＜5%間質細胞染色弱或未著色。強陽性染色結果定義為高表達，弱陽性和陰性染色結果定義為低表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。采用χ2檢驗和Fisher 確切概率法，觀察FAP 和MMP-9 兩指標在肝纖維化S1-S4 期和肝癌組織中的表達。FAP 和MMP-9 蛋白的相關性分析采用Spearman 等級相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAP 和MMP-9 在肝纖維化不同分期的表達 見表1 和圖1。

表l FAP和MMP-9在人乙肝相關性肝纖維化分期的表達（n）

圖1 不同分期肝纖維化組織中FAP和MMP-9的表達（PV-6000二步法×200）。A-C：隨著肝纖維化1-3期進展，FAP表達有增強趨勢。D：纖維化4期FAP表達明顯減弱。E-G：隨著肝纖維化1-3期進展，MMP-9表達有增強趨勢。H：纖維化4期MMP-9表達明顯減弱。

2.2 FAP 和MMP-9 在肝癌組織中的表達 32 例肝癌組織中均可見FAP 和MMP-9 的表達，分布于枯否細胞、腫瘤細胞團周圍及侵襲前沿的鄰近間質。肝癌組織中FAP 和MMP-9 高表達率分別為50%（16/32），43.8%（14/32）。而肝硬化組織中FAP 和MMP-9 基本上弱表達或不表達，其高表達率僅為3.1%（1/32），6.3%（2/32）。FAP 和MMP-9 在肝癌組織中的表達顯著高于肝硬化組織（P=0.000）。

2.3 FAP 和MMP-9 在非乙肝相關性肝病和正常肝組織中的免疫組化結果 對照組中11 例非乙肝相關性肝病的FAP和MMP-9高表達率分別為54.5%（6/11），9.1%（1/11）。正常肝組織的FAP 和MMP-9 表達均呈陰性。

2.4 FAP 和MMP-9 表達與肝癌臨床病理特征的關系 FAP 的高表達與肝癌患者的術前血清AFP、腫瘤數目、分化程度有關（P＜0.05），而與術前血清HBVDNA、腫瘤大小、脈管癌栓和周圍肝硬化無關（P＞0.05）。

2.5 FAP 和MMP-9 表達的相關性 Spearman 相關性分析顯示在人乙肝相關性肝纖維化和肝癌組織中FAP和MMP-9 的表達呈正相關，其中S2 和S4 期中呈顯著正相關（P＜0.05）。Spearman 相關性分析顯示在肝癌組織中FAP 和MMP-9 的表達有相關性，兩者成正相關（P＜0.05）。

3 討論

本研究發現人乙肝肝纖維化不同分期中FAP 和MMP-9 表達強度也有一定規律。正常肝組織FAP 和MMP-9 表達呈陰性，肝纖維化期FAP 和MMP-9 有不同程度陽性表達，隨著肝纖維化程度的增加FAP 和MMP-9 表達均有增強趨勢。另外，本實驗觀察到在纖維化4 期及肝硬化階段FAP 和MMP-9 表達均明顯減弱，與近癌周肝纖維化組織的FAP 和MMP-9 有較強的陽性表達形成了鮮明的對比。

同時作者發現在不同分期中MMP-9 的表達強度和范圍弱于FAP。考慮這可能與MMPs 隨著纖維化的進展，被金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）抑制有關。因為早有研究報道，TIMP 是MMP 的特異性抑制因子，以1：1 的比例形成MMP-TIMP 復合物，從而阻止MMP9 與底物結合，抑制其降解活性，在腫瘤的侵襲轉移中起負性調節作用［2］。

最近有作者通過克羅恩病黏膜的研究，觀察了纖維化組織中FAP、MMPs 及TIMP 的表達，發現狹窄型黏膜肌成纖維細胞FAP 表達上調，抗FAP 抗體治療狹窄組織時，膠原蛋白產生劑量依賴性下降，尤其是對I 型膠原蛋白的影響。治療還能減少克羅恩病狹窄時的TIMP-1 的產生，而不會改變MMP-3 和MMP-12 的分泌。提示了FAP、MMPs 及TIMP 在纖維化中導致平衡改變的作用［3］。

近年來，隨著腫瘤上皮-間質轉化的研究不斷深入，人們發現FAP 還表達于間葉組織來源的惡性腫瘤細胞中和上皮源性惡性腫瘤的成纖維細胞（TAFs）中，幾乎不表達于正常組織及良性上皮腫瘤間質中靜息成纖維細胞，且罕見于上皮性腫瘤細胞。Sukowati 等在人肝癌細胞株HuH-7 和JHH-6 培養中，癌癥相關成纖維細胞（CAFs）上調了TGFB1、FAP 的基因表達，提示CAF 作為間質干細胞，在肝癌發生和轉移過程中與肝癌細胞相互轉換的依據［4］。

在人肝癌的研究中，張等［5］采用PCR 方法檢測了33 例肝癌患者的肝癌組織、癌旁組織、遠隔相對正常肝組織以及13 例對照組的FAP mRNA 結果，均為陽性，但肝癌組織FAP mRNA 表達明顯高于癌旁及其余肝組織。另外，FAP mRNA 隨著肝癌臨床病程的進展以及分化程度的下降表達增多。本實驗采用免疫組化方法檢測蛋白表達，結果顯示肝癌組織中均可見FAP 和MMP-9 的表達，且顯著高于周圍肝組織。FAP的高表達與肝癌患者的術前血清AFP、腫瘤數目、分化程度有關。

綜合以上研究結合文獻，推測乙肝肝纖維化不同分期中FAP 和MMP-9 的作用機制。肝損傷早期，位于肝竇周圍的HSCs 增殖并激活，FAP 和MMPs 都被誘導表達。活化的HSCs 分泌多種因子，趨化HSC 向肝損傷部位遷移和增殖。因此，FAP 和MMPs 隨著纖維化發展表達增強，中期達到高峰。在肝纖維化后期包括肝硬化組織，IL-10 通過下調炎癥反應并增加組織間隙膠原酶的活性，使HSC 趨于靜止狀態，FAP 表達明顯減弱。因為MMPs 能被金屬蛋白酶組織抑制物抑制，所以表達比FAP 更弱。伴隨肝癌的發生，肝實質內固有的HSCs 被激活，活化HSCs 數量增多，所以近癌周肝纖維化組織有明顯的FAP 和MMPs 陽性表達。

兩者與肝癌發展的關系，目前尚不明確。有研究發現肝癌組織中HSC 的數量較正常肝組織明顯增多，且隨HCC 進展，其數量逐漸增多。HSC 可能通過分泌FAP 間接促進肝癌的發生與轉移。動物實驗發現敲除FAP 基因可以間接抑制腫瘤生長［6］。Huang 等［7］在乳腺癌體外研究發現，表達野生型FAP 或FAP（S624A）的細胞能更廣泛地降解細胞外基質（ECM），積累更高水平的MMP-9，更易侵襲I 型膠原。因此得出結論：FAP 的蛋白水解活性參與基質降解，但蛋白的其他功能促進腫瘤的增長。另有研究發現在肝硬化和肝癌組織中，實質-間質界面附近的肝細胞中神經肽Y 及其受體Y2R 增加，有機會與附近活化的間充質細胞中的FAP 相互作用。新發現提示了FAP 的底物特異性，揭示了FAP 在肝臟神經肽調節和癌癥生物學中的潛在功能。

綜上所述，FAP 和MMP-9 可能協同促進肝星狀細胞的活化，參與降解細胞外基質，從而促進肝纖維化和肝癌的發生發展。因此通過對FAP 和MMPs 的進一步研究，有望以HSCs 為靶標，為治療人乙肝相關肝纖維化和早期阻止肝癌侵襲轉移提供新的理論依據。