粘液性銅綠假單胞菌的藥敏現狀及同源性分析

朱峰

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是醫院感染中一種重要的革蘭陰性非發酵病原菌，其中粘液性PA 因其形態、培養及生物被膜形成等方面的特點［1］，在臨床致病和感染治療上具有獨特性。但因為目前臨床相對較低的檢出，導致無論是實驗室還是臨床對粘液性PA 的重視程度不夠，其體外藥敏檢測和臨床治療缺乏規范。為了解該菌對常用抗菌藥物的敏感性情況以及在本院的臨床分布，為該菌的臨床防治提供依據，作者對本院2018 年臨床檢出的粘液性PA 的分離情況及藥敏數據進行相關分析，并采用腸桿菌基因間重復共有序列PCR（ERIC-PCR）進行菌株同源性分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 研究菌株分離自2018 年1 月至12 月期間本院住院患者細菌學檢驗標本，PA 達324 株，其中粘液性PA 31 株（非重復分離）。標本類型包括：痰液、支氣管灌洗液、血液、清潔中段尿、傷口分泌物、腹腔引流液等。本次實驗藥敏檢測質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 主要儀器與試劑 實驗菌株的鑒定采用BD 公司生產 Phoenix-100 型全自動細菌鑒定儀。非粘液性PA的藥敏檢測采用BD Phoenix 100 及配套藥敏卡；粘液性PA 的藥敏檢測全部采用紙片瓊脂擴散法（K-B），藥敏紙片由英國OXOID 公司生產，分離培養基哥倫比亞血瓊脂平板和藥敏檢測培養基MH 瓊脂平板購自鄭州安圖公司。菌株同源性分析采用美國Bio-RAD 公司生產的全自動熒光定量PCR 儀反應體系進行，實驗中使用的Taq 酶及配套試劑由日本TaKaRa 公司生產，同源性檢測擴增引物ERIC2 均由上海生工生物有限公司合成。

1.3 細菌分離與鑒定 所有實驗菌株的臨床分離純化均依據《全國臨床檢驗技術操作規程》（第三版）操作。菌種的鑒定按照Phoenix-100 型全自動微生物分析儀標準操作指南，先挑取待鑒定實驗菌株單個菌落，使用含4.5%NaCl 的無菌水調制菌液至0.5 麥氏濁度，使用BD 配套的細菌鑒定卡片進行菌種鑒定。粘液型PA在哥倫比亞血平板上，37℃環境下，培養18～24h，菌落呈現為水滴樣、無色透明、不溶血的小菌落，易漏檢。48h 后逐漸形成溶血性不明顯、膠凍樣、粘稠的菌落，接種環常不易挑起，油鏡下為革蘭氏陰性桿菌，有類莢膜樣物質包裹菌體，氧化酶有時可為陰性，非粘液性PA 無此現象。粘液型PA 的鑒定和藥敏時間以培養48～72h 為準［2］。藥敏結果判斷依據CLSI 2018 標準。

1.4 同源性檢測方法 采用煮沸法進行PCR 模板制備，將ERIC-PCR 反應溶液（去離子水9μl、RTaq DNA 聚合酶反應體系12.5μl、引物ERIC2 1.5μl 和模板2μl）25μl，放置于PCR 儀中，擴增條件為94℃預變性4min，隨后94℃下變性40s、再40℃退火1min、接著72℃延伸5min，需運行40 個循環，最后在72℃下延伸10min 結束。ERIC-PCR 產物進行電泳成像后，根據與Marker 的對應位置，具有相同圖譜的視為相同基因型，具有不同圖譜的視為不同。

1.5 統計學方法 菌株數據的整理和處理采用WHONET5.6 分析軟件，運用SPSS17.0 軟件進行抗菌藥物敏感性的統計分析，敏感率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 粘液性PA 分離情況 2018 年度本院從臨床非重復分離菌株共3326 株，其中PA 為324 株（9.74%），粘液性PA 為31 株，占比為9.57%。

2.2 粘液性PA 臨床分布 31 株臨床分離的粘液性PA 來源主要集中于下呼吸道標本，其中痰液29 例、支氣管灌洗液1 例、尿液1 例。主要來源于呼吸內科（67.7%）、ICU（9.7%）、急診內科（6.5%）、消化內科（6.5%）、門診（6.5%）和感染科（3.1%）。

2.3 粘液性PA 和非粘液性PA 敏感性差異比較 見表1。

表1 粘液性PA和非粘液性PA敏感性差異比較（%）

2.4 粘液性PA 同源性分析 31 株粘液性PA 經ERIC-PCR 基因分型，主要分為A、B、C、D 4 型，其中A 型20 株，B 型5 株，C 和D 型各3 株。部分菌株ERIC-PCR 分型圖譜如圖1 所示。

3 討論

圖1 部分實驗菌株ERIC-PCR分型圖譜。注：M為DNA Marker；泳道1、2、3、6、7、8、9、10、12菌株為A型；泳道5、11菌株為B型；泳道4菌株為C型。

本資料結果顯示，2018 年本地區粘液性PA 檢出31 例，占比為9.57%。非粘液型PA 通常不產生粘液和生物膜，但在缺少磷酸鹽、氯化鈉含量較多、高滲透壓等環境下非粘液型PA 易轉化為粘液型。因此，對于粘液性PA 的形成條件和檢出率的動態關注，也尤為重要。統計結果表明，31 例粘液型PA 主要來自痰液等呼吸道標本，其科室來源于呼吸科和重癥監護等呼吸道疾病集中病區。這也進一步證實了本菌與呼吸道疾病間的相關性。也有較多報道［3-4］顯示，粘液型PA 在慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺炎患者標本中檢出率高。這可能與粘液型PA引起的感染清除較困難，容易反復有關。由于產粘液型PA 的粘液減少和阻斷了細菌的外界營養供應，使該菌生長明顯減慢，一般需要48h 才能生長，并且在生理鹽水中不容易形成均勻的菌懸液，導致在使用自動化儀器鑒定和藥敏試驗時，無法鑒定或者結果不準確。因此對于產粘液型PA的鑒定應該在儀器鑒定的基礎上，再結合菌落形態和附加生化反應加以確認。其藥敏檢測應當選擇＞48h生長菌落，采用標準紙片擴散法進行［2］。但目前國內較多微生物實驗室由于人員配備少、工作量繁重以及認識不夠等因素，對于粘液型PA 的檢測和報告缺乏規范性，甚至和非粘液性PA 根本不做區分，從而給臨床治療帶來諸多困難。

由于粘液性PA 不易形成均勻菌懸液的特點，導致在使用儀器藥敏檢測時，藥敏卡片上各抗菌藥物檢測孔中菌液濃度分布不均，引起藥敏檢測結果出現偏差，而紙片法使用較為直觀的瓊脂擴散方法，避免了菌液濃度不均引起的誤差。本資料結果表明31 株粘液性PA 對目前臨床常用抗假單胞菌藥物如亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦和環丙沙星的敏感性明顯高于同時期臨床分離的非粘液性PA。雖然粘液性PA 對臨床常用抗假單胞菌藥物具有較好敏感性，但目前在治療粘液型PA 引起的感染時，臨床治療效果不佳，這主要可能是因為粘液性PA 表面的脂蛋白、纖維蛋白、藻酸鹽等多糖蛋白復合物，包裹在細菌周圍粘連成膜狀物，即生物被膜，這種生物膜處于類凝膠狀態，目前較為統一的認識為大環內酯類抗菌藥物可以抑制和破壞生物被膜，作為聯合用藥使用時具有較好療效［5］。

粘液性PA 因其易定植的生物學特性，常能夠引起醫院內感染的發生，尤其容易在如呼吸科、老年康復、ICU 等病區發生克隆傳播，因此對其實施及時的監控相當必要。作者運用ERIC-PCR 方法對本院粘液性PA進行了同源性分析，發現31 株粘液性PA 的基因型主要為A 型，具有較高的同源性，說明可能存在院內的克隆傳播。其原因可能與臨床的隔離消毒、無菌操作、侵入性診療等密切相關。因此采用確實有效的措施對于預防和控制此類病原菌的院內傳播與感染至關重要。