Lnc RNA PCGEM1通過TGF β2/Smad2信號通路調控食管癌細胞侵襲和轉移研究

劉 勇, 王 斌, 金建琴, 陳思思

(湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院， 湖北 十堰 442000)

作為惡性腫瘤，食管癌(esophageal cancer，EC)死亡率一直居于首位，對人們的生命健康造成了嚴重的威脅。EC早期癥狀不明顯，患者在就診時往往處于晚期，目前治療EC的主要手段是手術及術后化療藥物灌注，但患者的5年生存率僅有10%[1]，因此尋找新的治療靶點尤為迫切。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，Lnc RNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度介于200～100000 nt之間[2]。研究表明[3]，Lnc RNA在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉移與化療耐藥等相關的信號通路方面均發揮調節作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因。Lnc RNA PCGEM1是一種在前列腺癌細胞中特異性高表達的Lnc RNA，并已證實可促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。但目前關于PCGEM1在EC中的作用研究報道甚少，因此，本研究通過對EC組織和Eca-109細胞株的研究，探討PCGEM1在EC進展中的作用機制。

1 材料和方法

1.1組織標本：收集2016年3月至2018年5月于我院接受手術治療的62例EC患者癌組織及距離癌組織超過2cm處的正常組織，所有病例標本經組織病理學檢測證實為原發性EC，其中腺癌32例，鱗癌30例。患者年齡35～76歲，中位年齡55歲。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經我院倫理委員會審核批準后收集標本。

1.2細胞及主要試劑和儀器:人正常食管上皮細胞HET-1A，人食管癌細胞株Eca-109、SHEEC1、Ec-9706、EC8712、TE-1均購自上海賽百慷生物技術股份有限公司。siPCGEM1及陰性對照siNC、miR-148a-minic及陰性對照NC-minic，PCGEM1及U6引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計完成。DMEM培養基(D777)；SYBR Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(QPK-201)于TOYOBO采購；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；MTT試劑盒購自碧云天；Western blotting底物試劑盒及抗體購自北京百奧萊博科技有限公司。蘇凈Airtech超凈工作臺；SANYO MCO-15AC細胞培養箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；5810R 型高速離心機；Roche R480實時熒光定量PCR儀。

1.3細胞轉染:調整食管癌Eca-109細胞株濃度至1×106個/mL，取2mL接種于6孔板中，培養過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmoL/L的siPCGEM1和陰性對照轉染至細胞，細胞分為：Eca-109-siPCGEM1組和Eca-109-siNC組，以Eca-109作為空白對照組。收集對數生長期的Eca-109-siPCGEM1細胞，采用上述方法轉染simiR-148a及陰性對照siNC-minic，并分為Eca-109-siPCGEM1+simiR-148a組和Eca-109-siPCGEM1+simiR-148a組。

1.4qRT-PCR檢測Lnc RNA PCGEM1的表達:采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉錄，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性10min，然后95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 10s，40 個循環；95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 30s。U6作為內參(上游引物為 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為 5'AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')，Lnc RNA PCGEM1(上游引物為 5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3')，miR-148a(上游引物為 5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3')相對表達量用2-△△CT表示。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.5MTT及平板克隆實驗檢測細胞增殖:將各組細胞按照每孔500-1000 個密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養箱繼續培養，每孔加MTT溶液20μl，37℃避光4h 后，棄掉孔內液體，再加DMSO各100μl，置于37℃搖床上快速振蕩15min，以便充分溶解結晶物，最后將96 孔板置于酶標儀上檢測 492nm 處的OD值。將上述兩種穩轉細胞按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續培養，隔周更換新鮮培養液，2周后用考馬斯亮藍染色，在顯微鏡下計數菌落形成數量。

1.6劃痕實驗檢測細胞遷移:將各組細胞E按5×105均勻鋪至6孔板，用10μl白槍頭劃線并以尺子輔助，加PBS將細胞碎片沖洗掉，然后加1%血清的培養基，置于顯微鏡下拍照并做好標記，此時記為0h，繼續于37℃、5%CO2溫箱培養，培養24h于倒置顯微鏡下觀察細胞運動情況并拍照。

1.7生物信息學預測:使用生物信息學網站StarBase預測PCGEM1可互補結合的微小RNA(microRNA，miRNA)，在根據Targetscan網站預測相應miRNA可靶向結合的基因。

1.8Western blotting檢測:將轉染48h的Eca-109細胞，加入適量的RIPA裂解液，裂解30min，12 000/min 4℃離心10min，收集上清，采用ECA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25μl，濃縮膠時調整電壓為60V，分離膠電壓為120V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2h，加入TGF-β2、Smad2一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.9統計學分析:用SPSS19.0對實驗數據進行統計分析，計量資料以平均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩采用獨立樣本t檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Lnc RNA PCGEM1在EC不同組織和細胞中的表達:qRT-PCR結果顯示，EC組織中 Lnc RNA PCGEM1的表達水平高于癌旁組織，且差異有統計學意義(P<0.05)； Lnc RNA PCGEM1在腫瘤細胞中的表達明顯高于人正常食管上皮細胞HFT-1A，差異均具有統計學意義(P<0.05)，其中在Eca-109細胞中表達量最高(P<0.01)，適合使用RNA干擾的方法進行后續Lnc RNA PCGEM1基因功能的研究，見圖1。

圖1 Lnc RNA PCGEM1在EC組織和不同EC細胞系中的表達(A：Lnc RNA PCGEM1在不同組織中的表達；B：Lnc RNA PCGEM1在不同EC細胞系中的表達，與HET-1A相比，*P<0.05，**P<0.01)

2.2細胞系構建:qRT-PCR結果顯示空白對照組和陰性對照組Lnc RNA PCGEM1的表達無統計學意義(P>0.05)，Eca-109-siPCGEM1組細胞中Lnc RNA PCGEM1的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示成功構建PCGEM1沉默細胞系，見圖2。

圖2 Lnc RNA PCGEM1在各組Eca-109細胞中的表達

2.3Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109增殖能力的影響:平板克隆實驗結果顯示，沉默lnc RNA PCGEM1后，Eca-109-siPCGEM1細胞克隆數顯著減少(P<0.05)，空白對照組與Eca-109-siNC組間差異無統計學意義(P>0.05)。說明Lnc RNA PCGEM1被沉默后，細胞增殖能力顯著降低，見圖3。

圖3 Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109增殖能力的影響(A：平板克隆實驗檢測細胞增殖；B：各組Eca-109細胞平板克隆結果)

2.4Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109遷移能力的影響:細胞劃痕實驗結果，相比空白對照組Eca-109和陰性對照組Eca-109-siNC，Eca-109-siPCGEM1組細胞運動能力減弱，細胞的創傷愈合速率降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明沉默lnc RNA PCGEM1后，細胞遷移能力明顯下降，見圖4。

圖4 Lnc RNA PCGEM1對EC細胞株Eca-109遷移能力的影響(A：劃痕實驗檢測細胞遷移能力；B：遷移細胞數)

2.5生物信息學預測:采用StarBase網站預測結果顯示，Lnc RNA PCGEM1可與miR-148a互補結合，再經Targetscan網站預測分析顯示，miR-148a與TGFβ2存在靶向結合位點，qRT-PCR結果顯示，Eca-109-siPCGEM1組中miR148的表達明顯高于空白對照組與Eca-109-siNC組(P<0.05)，見圖5。

圖5 生物信息學預測Lnc RNA PCGEM1與TGFβ2的關系(A：StarBase網站預測NEAT1與miR-148a互補結合位點；B：Targetscan預測miR-148a與TGFβ2靶向結合位點；C：miR-148a在不同細胞中的表達)

2.6下調miR-148a驗證Lnc RNA PCGEM1對Eca-109細胞的影響:Eca-109細胞沉默Lnc RNA PCGEM1后，再下調miR-148a觀察食管癌細胞增殖和遷移能力，siPCGEM1+simiR-148a組中miR-148a相對表達量明顯低siPCGEM1+siNC組(P<0.05)，提示沉默細胞系構建成功；平板克隆實驗和劃痕實驗顯示，siPCGEM1+simiR-148a組細胞克隆數明顯增多，細胞運動能力增強(P均<0.05)，說明下調miR-148a可逆轉Lnc RNA PCGEM1沉默對Eca-109細胞的影響，見圖6。

圖6 下調miR-148a驗證Lnc RNA PCGEM1對Eca-109細胞的影響(A：不同細胞中miR-148a的表達；B：平板克隆實驗檢測細胞增殖；C：各組Eca-109細胞平板克隆結果；D：劃痕實驗檢測細胞遷移能力；E：遷移細胞數)

2.7Lnc RNA PCGEM1與TGF β2/Smad 2的作用關系:Western blot檢測結果顯示Eca-109-siPCGEM1組中TGF β2及Smad 2的表達明顯低于空白對照組與陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組中上述指標的表達量差異無統計學意義(P>0.05)，提示Lnc RNA PCGEM1對TGF β2/Smad 2通路蛋白表達的具有促進作用，見圖7。

圖7 Lnc RNA PCGEM1與TGF β2/Smad 2的作用關系(a：miR-148a在Eca-109細胞中的表達；b：Western blotting檢測TGF β2和p-Smad2在Eca-109細胞中的表達；c：TGF β2和p-Smad2在Eca-109細胞中相對表達量，與空白對照組相比，*P<0.05)

3 討 論

隨著人們飲食結構和生活方式的改變，食管癌在多數國家的發病率均呈明顯上升趨勢。雖然近年來醫療技術取得飛速發展，但食管癌的發病、浸潤和轉移是由多種分子參與的復雜過程，已有的治療手段不能抑制腫瘤細胞的增殖，導致治療的失敗。因此從分子生物學角度出發尋找其進展和轉移的標志物，對于患者選擇合適的治療方法和預后指標的判定有著重要的意義。

目前關于Lnc RNA在腫瘤中的作用僅有一小部分被透徹研究，有些Lnc RNA在腫瘤中的表達異常改變，功能類似于癌基因或抑癌基因，可通過參與調控細胞周期，影響癌癥的發生發展[4]。目前，尚無標志性Lnc RNA可以直接預測EC，但Lnc RNA PCGEM1在前列腺癌中特異性表達已由Srikantan等證實，該基因位于染色體2q32位點上。Zhang等[5]采用RT-PCR檢測發現PCGEM1在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。Chen等[6]人研究表明在胰腺癌患者癌組織和血清中，Lnc RNA PCGEM1的表達量上升。Lnc RNA PCGEM1在胰腺癌細胞分化過程中表達量顯著升高，而被沉默后，胰腺癌細胞的增殖能力減弱，并且增殖相關的基因亦表達量下降，由此推測Lnc RNA PCGEM1對胰腺癌細胞的增殖起到促進作用。本研究采用RT-PCR檢測其在EC組織和癌旁組織中的表達發現，在EC組織中表達水平明顯高于癌旁組織，提示Lnc RNA PCGEM1在EC的發生發展中可能起著重要作用。為了進一步研究Lnc RNA PCGEM1在EC中的作用，本研究構建了PCGEM1沉默細胞系，結果顯示Lnc RNA PCGEM1下調后，EC癌細胞Eca-109的增殖能力和遷移能力明顯下降。

研究表明[7]，miRNA是通過堿基不完全互補的方式結合于靶基因上，從而影響腫瘤細胞的凋亡、遷徙與轉移，并引發周圍細胞的壞死與凋亡。同時miRNA也是Lnc RNA發揮作用的重要環節。本研究應用StarBase數據庫，預測Lnc RNA PCGEM1可與miR-148a互補結合。李張維等[8]研究發現，miR-148a在食管癌組織中表達低于正常癌旁組織，上調miR-148a表達可抑制食管癌細胞的增殖和遷移，miR-148a作為癌基因對食管癌的進展發揮促進作用。本研究中，Eca-109細胞Lnc RNA PCGEM1沉默后，miR-148a表達上調，而下調miR-148a可逆轉Lnc RNA PCGEM1基因沉默后Eca-109細胞株的生物學行為，提示Lnc RNA PCGEM1促進EC細胞株Eca-109的增殖作用可能與下調miR-148a有關。根據Targetscan 網站預測顯示，miR-148a可互補結合TGF β2。本研究中，miR-148a表達上調后，TGFβ2蛋白的表達降低。TGF-β2/smad2 信號通路在腫瘤的發生發展中扮演了重要角色，該通路通過磷酸化轉錄因子Smad 蛋白，實現細胞內通路信號的傳導[9]。Smad 蛋白包括 Smad1-Smad9，其中當 Smad2磷酸化水平受到抑制甚至沉默時，TGF-β2/Smad2信號通路的生物學功能發生轉變，對腫瘤細胞增殖和侵襲起到抑制作用[10]。在本次實驗中，我們發現過Eca-109-siPCGEM1組細胞中Smad2磷酸化水平明顯降低。王勁等發現[11]，下調Lnc RNA PCGEM1可調節TGF β2的表達從而抑制結直腸癌的侵襲及遷移。因此推斷，Lnc RNA PCGEM1可能通過調節 TGF-β2/smad2 信號通路影響癌癥的進展。

綜上所述，Lnc RNA PCGEM1在食管癌中高表達，高表達Lnc RNA PCGEM1可能通過上調miR-148a水平，強化TGF β2/Smad2信號通路，從而促進EC的進展。可以將Lnc RNA PCGEM作為研究的新方向，為新型的生物藥品提供理論基礎。