抑制MicroRNA-27b調控Nrf2/ARE信號通路對高血壓性腦出血大鼠模型腦損傷的機制研究

劉小江， 李 軍， 管義祥

(江蘇省海安市人民醫院神經外科， 江蘇 海安 226600)

腦出血是臨床上的危急重癥之一，發病占腦卒中的10%～30%，具有高發病率、高死亡率和低治愈率的特點[1]。高血壓性腦出血(hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH)是由于高血壓常導致腦內小動脈血管壁上發生玻璃樣或纖維樣病變，進而引起已病變的動脈破裂出血所致，約占自發性腦出血的70%～80%[2]。HICH發生后，血管破裂出血會引發血腫壓迫病灶周圍腦組織，繼發腦水腫，導致神經細胞受損，誘發腦部炎癥變化，激活神經細胞凋亡，并最終引起繼發性腦組織損傷。目前，手術清除血腫可緩解周圍腦組織的機械性壓迫，但是針對出血引起的繼發性腦損傷仍缺乏有效治療手段。MicroRNAs(miRs)是一類由內源基因編碼、長度在19～25個核苷酸的小RNA[3]。MiRs與靶標mRNA的3'-UTR區結合，可以降解或抑制靶向mRNA的翻譯，抑制轉錄后水平的蛋白質表達，參與調節細胞的生長、分化、代謝、增殖和凋亡。MiR-27b是miR-27家族的一個亞型。近年來眾多研究表明，miR-27b具有響應生物體氧化應激(oxidative stress，OS)反應的功能，并參與Ⅱ型糖尿病、神經膠質瘤、胃癌等多種疾病的發生、發展[4]。Nrf2/ARE信號通路是生物體內最重要的抗氧化信號通路，可被外界各種OS所誘導，通過活化后的轉錄因子核因子相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)與其DNA結合序列antioxidant response element(ARE)結合并激發下游靶基因的表達。這些靶基因主要包括血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，Nqo1)和甘肽過氧化酶1(glutathione peroxidase，Gpx1)等[5]。目前miR-27b與HICH之間的關系缺乏相關報道，Nrf2/ARE信號通路在HICH中的表達變化也尚未明確。因此，本研究擬通過調控miR-27b在HICH大鼠中的表達，分析miR-27b對Nrf2/ARE信號通路關鍵蛋白以及HICH的影響，探討尋找治療HICH的藥物新靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1動物分組:普通級健康雄性Wistar大鼠60只，體重220～270g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。隨機分為以下4組，Sharm組、HICH組、HICH-NC組和HICH- antagomir組，每組各45只。

1.2HICH大鼠模型的制備:首先采用雙側腎動脈前支部分熱凝、高鹽高脂高膽固醇飲食飼養6周后建立大鼠高血壓模型，期間每周用RBP-1B型大鼠血壓計行尾部血壓測量1次。在上述高血壓模型基礎上，采用立體定位儀下自體血腦內注入法建立高血壓腦出血模型。具體步驟為：用100g/L水合氯醛350mg/kg體質量腹腔內注射麻醉大鼠，腹位固定于定向儀上，頂部剃毛消毒后正中矢狀位切開，在前囟后0.2mm，右旁開3.0mm處行顱骨鉆，用50℃溫水加溫鼠尾，斷尾取血100μL，在立體定向儀下進針6.0mm(相當于尾殼核部)，3min內將50μL血注入大鼠腦內(相當于人腦出血40mL)，留針10min后退出，縫合頭皮。Sharm組采用腦出血模型制備同種方法，但進針后不注血，注入50μL生理鹽水代替自體血。HICH大鼠前3d，HICH組、HICH-NC組和HICH- antagomir組分別將5μL生理鹽水、5μL(20nmoL/L)拮抗劑陰性對照、5μL(20nmoL/L)miR-27b拮抗劑注入大鼠右側腦室，具體坐標為前鹵后1.5mm，中線右側旁開1.1mm，立體定位儀下進針4.5mm。miR-27b拮抗劑購自Ribobio(China)。Sharm組采用同種方法，注入等量生理鹽水。

1.3qRT-PCR檢測miR-27b、Nrf2基因表達:分別在造模后的第6h、12h、24h、48h和72h，采用qRT-PCR檢測HICH組大鼠和Sharm組大鼠miR-27b及Nrf2 mRNA水平。取大鼠出血部位紋狀體腦組織，Trizol法(Invitrogen，USA)提取總RNA。miR-27b mRNA 5'-3'端引物序列為TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC；Nrf2 mRNA 5'-3'端引物序列為TTTGTAGATGACCATGAGTCGC，3'-5'端引物序列為TGTCCTGCTGTATGCTGCTT。按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，Japan)和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit(Takara，Japan)分別合成cDNA。以cDNA為模板，按照熒光定量PCR試劑盒TB Green Premix Ex Taq (Takara，Japan)說明書步驟進行qRT-PCR實驗，miR-27b mRNA 3'-5'端引物為試劑盒常用引物。2-ΔΔct進行數據定量分析。

1.4Western Blot檢測Nrf2、HO-1和Nqo1蛋白質表達:取大鼠紋狀體腦組織，加入RIPA細胞裂解液(Beyotime，China)，4℃下制備組織勻漿。BCA試劑盒(Beyotime，China)測定蛋白濃度，根據所測蛋白濃度計算上樣體積。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加一抗Nrf2(1:1000，Abcam，UK)、HO-1(1:10000，Abcam，UK)、Nqo1(1:1000，Abcam，UK)及β-actin(1:1000)4℃孵育過夜。第2天加二抗室溫孵育2h，TBST洗膜后，GE Amersham Imager 600顯影成像，ImageJ軟件定量分析各組蛋白表達差異，以β-actin為內參，進行蛋白表達相對定量計算。

1.5SOD、TNF-α和IL-1β水平檢測:在給藥造模后的24h，處死大鼠，出血部位提取腦組織制備10%組織勻漿，離心10min。SOD檢測采用黃嘌呤氧化法，嚴格按照試劑盒說明書進行各項操作內容，試劑盒采購自南京建成生物工程研究所。TNF-α和IL-1β檢測采用Elisa，試劑盒購自Bio-Rad(USA)，操作按照試劑盒說明書進行。

1.6TUNEL法流式細胞分析法檢測神經組織細胞凋亡:采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)進行細胞凋亡檢測，實驗過程根據試劑盒(Roche，US)要求操作，使用Image-pro plus系統分析在光學顯微鏡(每組選擇5個隨機的視野，400X放大率)下觀察到的陽性細胞數。流式細胞分析法取各組新鮮腦組織4℃研磨制成組織勻漿，篩網過濾后加入PBS溶液配成細胞懸液，1000 rpm離心5 min，用PBS緩沖液洗滌上清液細胞。之后1000rpm再次離心5min，向沉淀中加入500μL膜聯蛋白結合緩沖液，吹打混勻，加入5μL的Annexin V- FITC試劑常溫避光靜置10min，加入10μL PI試劑室溫下避光孵育5min。流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度，分析細胞凋亡百分率。

2 結 果

2.1HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA水平的變化:與Sham組比較，miR-27b表達量在HICH后6 h顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05),并在24 h達到最低水平(P<0.05)，隨后miR-27b水平開始上升，在72 h逐漸恢復至正常水平(P>0.05)。同時，Nrf2 mRNA水平也呈現出時間依賴性變化。在HICH后的6h，Nrf2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，并在24 h 達到最高水平(P<0.05)，隨后Nrf2 mRNA表達量開始下降，在72 h后逐漸恢復至正常水平(圖1)。這些結果表明miR-27b與Nrf2信號通路之間存在明顯的負相關性。

圖1 不同時間點HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA表達情況。*表示與Sharm組比較

2.2miR-27b拮抗劑誘導HICH大鼠Nrf2/ARE信號通路Nrf2、HO-1、Nqo1表達激活:為進一步探究miR-27b與Nrf2/ARE信號通路之間的關系，我們通過側腦室注射miR-27b拮抗劑，測定Nrf2/ARE下游蛋白的表達情況。結果見圖2。與Sharm組相比，HICH組Nrf2、HO-1、Nqo1蛋白表達量顯著提高(P<0.05)，而注射miR-27b拮抗劑的HICH-antagomir組Nrf2、HO-1、Nqo1表達與HICH組相比，表達量則進一步提高，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明miR-27b拮抗劑可以進一步激活Nrf2/ARE下游抗氧化蛋白的表達。

圖2 miR-27b拮抗劑促進Nrf2/ARE信號通路下游蛋白表達。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

2.3miR-27b拮抗劑對HICH大鼠腦組織氧化損傷和神經炎癥的作用:進一步驗證miR-27b拮抗劑對HICH誘導的OS的影響，如圖3所示。與HICH組比較，HICH-antagomir組SOD水平顯著提高，TNF-α和IL-1β水平則顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明miR-27b拮抗劑有效緩解了HICH對大鼠腦組織造成的氧化損傷以及神經炎癥。

圖3 miR-27b拮抗劑緩解HICH大鼠腦組織氧化損傷和神經炎癥。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

2.4miR-27b拮抗劑緩解HICH大鼠腦組織神經細胞凋亡:為了檢測miR-27b拮抗劑對HICH大鼠腦組織神經細胞凋亡的影響(圖4)。分析各組實驗結果，HICH組陽性細胞比率比Sham組顯著提高(58.85±6.89% vs. 8.79±1.52%)，差異具有顯著性(P<0.01)。HICH-antagomir組與HICH組比較，TUNEL陽性比率則顯著降低(29.52±3.69% vs. 58.85±6.89%)，差異具有顯著性(P<0.05)。流式細胞圖顯示Sham組細胞凋亡率3.06%；HICH細胞凋亡率50.00%；HICH-NC組細胞凋亡率36.58%；HICH-antagomir組細胞凋亡率12.2%。這些結果表明miR-27b拮抗劑對HICH大鼠腦組織神經細胞凋亡具有一定的緩解效果。

圖4 TUNEL法和流式細胞分析法檢測神經細胞凋亡。*表示與Sharm組相比；#表示與HICH組相比

3 討 論

在腦實質中HICH造成血液成分發生崩解，進而引發大量活性氧組(reactive oxygen species，ROS)釋放，誘發OS，造成脂質、DNA、蛋白質等發生氧化損傷以及神經炎癥，最終導致神經細胞凋亡，是造成繼發性腦損傷的主要原因。本研究發現，在HICH大鼠模型中抑制miR-27b的表達，能夠有效緩解HICH造成的氧化損傷以及神經炎癥，對HICH導致的繼發性腦損傷具有保護作用。有研究表明，抑制miR-27b可能與Nrf2/ARE信號通路的激活有關，這與我們的研究結果一致[6]。

最近的一些研究表明，生物體內的OS可以通過影響miRs裝配成熟的關鍵分子來調節miR的生物學功能，同時miRs本身也可以被OS調節，從而改變miRs的完整性、穩定性和生物學功能[7]。目前有多種miR通過抗氧化途徑參與到對OS的細胞應答。MiR-27b是一類與OS有關的miRs，在生物體內受到氧化刺激后，miR-27b表達被明顯抑制[8]。在本研究中，HICH大鼠腦內的miR-27b表達量在造模后發生了明顯下降，說明HICH大鼠腦內可能產生大量OS。檢測SOD、TNF-α和IL-1β水平發現，SOD水平與Sham組相比顯著降低，同時TNF-α和IL-1β水平則顯著上升。進一步驗證了HICH大鼠腦內發生嚴重的OS和神經炎癥反應。Nrf2是維持細胞內氧化還原穩態的關鍵調節因子，是miR-27b的潛在靶標分子。HICH模型大鼠中進行的miR-27b和Nrf2 mRNA表達研究結果顯示，miR-27b的下調的同時，大鼠的Nrf2 mRNA表達顯著上調，說明miR-27b和Nrf2表達之間可能存在負相關性。鑒于Nrf2在大鼠HICH模型中的神經保護作用以及Nrf2與miR-27b之間潛在的相互作用，我們認為miR-27b表達的下調可被視為對HICH的保護性應答機制。

生物體內，SOD具有清除自由基和阻斷自由基觸發的脂質過氧化反應及細胞損傷的作用[9]。TNF-α和IL-1β則是NF-kB表達的下游響應因子，是參與生物體炎癥反應的重要因子[10]。HICH模型大鼠側腦室注射給藥miR-27b拮抗劑，抑制miR-27b的表達發現，miR-27b表達量降低會激活Nrf2/ARE下游靶標蛋白HO-1、Nqo1的表達，使HICH大鼠腦組織內的SOD水平逐漸恢復至正常狀態，TNF-α和IL-1β水平同時也會顯著降低。表明miR-27b表達降低能夠激活Nrf2/ARE信號通路，有效緩解HICH模型大鼠體內的氧化損傷和神經炎癥。MiR-27b拮抗劑的使用同時也大幅度降低了腦組織內神經細胞的凋亡。這些結果提示，通過抑制miR-27b的表達，激活Nrf2/ARE信號通路，對于HICH模型大鼠的腦損傷具有一定的療效，這為進一步研發HICH藥物提供了理論基礎。