血漿D－二聚體對IVF／ICSI患者控制性促排卵后妊娠結局的預測價值

連若純，徐仕儒，許健，刁梁輝，黃春宇，曾勇

（深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

控制性促排卵（COH）是IVF－ET的首要步驟和關鍵環節，為了獲得更多成熟卵母細胞，使用大劑量的促排卵藥物，可導致嚴重的并發癥——卵巢過度刺激征（OHSS）的發生。研究發現，持續高雌激素水平是導致OHSS發生的重要病因，且OHSS的發生與高凝狀態、血栓形成密切相關［1－2］。隨著輔助生育技術的進步和需求量增加，如何提高IVF／ICSI－ET成功率，降低OHSS發生概率，也越來越受關注。D－二聚體是高凝狀態和內源性纖溶系統的重要標志物，是預測血栓事件的重要指標之一［3］。但雌二醇（E2）水平與D－二聚體之間是否存在相關性，可否通過D－二聚水平預測OHSS發生風險，目前鮮有研究。另外，妊娠本身是一種高凝狀態，隨著早期、中期、晚期妊娠的發展，D－二聚體水平隨之顯著升高，并且與孕周顯著正相關，但早孕期D－二聚體水平并不能預測早期流產的發生［4］。但有研究提出，復發性流產患者早孕期D－二聚體水平顯著升高，存在血栓形成傾向，檢測血漿D－二聚可能可預測復發性流產患者發生血栓的風險，提前給予干預治療可以改善妊娠結局［5］。關于D－二聚體對妊娠結局的預測作用仍存在爭議。本研究旨在分析COH后高水平E2與D－二聚體之間的相關性，評估D－二聚體預測IVF／ICSI－ET患者發生OHSS及不良妊娠結局的潛在價值。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2017年5月于我院生殖科行IVF／ICSI治療的100例不孕不育患者的病歷資料，年齡20～38歲，均采用黃體期長方案促排卵。入選標準：（1）年齡≤38歲；（2）采用黃體期長方案促排卵；（3）雙側卵巢基礎竇卵泡數＞6個，男方非手術取精。排除標準：（1）多囊卵巢綜合征患者；（2）高血壓病史、糖尿病病史、動靜脈血栓病史、肝臟疾病、腎臟疾病、系統性紅斑狼瘡病史患者；（3）吸煙患者；（4）近2月服用過避孕藥或雌孕激素類藥物；（5）HCG注射日或之前已確定不行新鮮胚胎移植患者。排除其他因素后，實際入組69例，根據妊娠結局分為：正常妊娠組（44例），即成功分娩者；妊娠失敗組（25例），包括移植后未妊娠、生化妊娠丟失、流產等情況。

二、研究方法

1．標本采集：所有患者均接受黃體期長方案COH。血樣采集時間點：（1）黃體期降調日（促排前）：黃體期使用降調節藥物進行治療當天；（2）HCG注射日（扳機日）：使用HCG注射進行扳機當天；（3）新鮮胚胎移植后2周（驗孕日）：驗孕日是患者移植胚胎后2周進行血HCG測定日。用枸櫞酸鹽1∶9抗凝管抽取外周血2ml，1 500g離心 15min，待用。

2．D－二聚體檢測方法：檢測方法為酶聯免疫吸附法（ELISA法），采用酶聯免疫夾心兩步法和熒光檢測（ELFA）相結合的原理，根據檢測試劑盒的說明書，讀取mLE批號信息，校正標準曲線后，放入試劑盒的試劑條和固相管SPR，加入200μl枸櫞酸鈉抗凝血血漿，然后按開始鍵開始自動檢測并打出結果報告。檢測試劑：D－二聚體排除試驗試劑盒（SA，法國）。異常指標：＞500ng／ml。

3．IVF－ET 促排方案：采用黃體期長方案COH，用短效注射用曲普瑞林 （達菲林，博福益普生，法國）。降調節，達到降調標準后開始使用注射用重組FSH（果納芬，雪蘭諾，瑞士）或注射用尿FSH（麗申寶，珠海麗珠制藥）促排卵，促排卵當日短效達菲林改成0．05mg／d，陰道超聲監測卵泡發育。當有兩個主導卵泡直徑≥18mm時，當晚肌肉注射 HCG 10 000U，34～36h后在陰道 B超引導下穿刺取卵，同時記錄獲卵數。取卵3～4h后受精，16～18h后觀察受精情況，并繼續培養至72h左右移植1～3個胚胎，同時記錄受精數、卵裂數、優質胚胎數。取卵當天即開始行黃體支持治療，采用黃體酮60mg／d肌肉注射支持黃體。移植術后13d初步確診早孕，移植后30d超聲檢查宮內有孕囊及胎芽、胎心搏動則診斷臨床妊娠，即成功妊娠。為降低OHSS發生率，取卵個數≥20取消新鮮胚胎移植。

三、統計學分析

利用SPSS 23．0軟件進行統計分析。計量資料數據結果以（）表示。兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組之間比較采用單因素ANOVA檢驗；兩變量之間的相關性采用Pearson相關性分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料

本研究中行IVF／ICSI治療的100例不孕癥患者均接受黃體期長方案COH，平均取卵（12．1±3．7）個，MⅡ卵（11．2±3．3）個，所有患者促排前后均未發現血栓相關疾病病史。其中31例患者因以下原因取消新鮮胚胎移植：宮腔異常（1例）、高孕酮水平（2例）、抗磷脂綜合征高滴度（3例）、取卵個數≥20個疑似OHSS或確診輕度OHSS（25例）。另69例進行新鮮胚胎移植，HCG陽性率78．3%（54／69），胚胎著床率50．0%（66／132），臨床妊娠率68．2%（47／69），異位妊娠1例，2例發生早期流產，其中1例為絨毛染色體非整倍數目異常。

根據妊娠結局將69例患者分為正常妊娠組（n＝44）與妊娠失敗組（n＝25），兩組患者年齡、基礎FSH、AMH、BMI、不孕年限、Gn使用劑量等均無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

表1 正常妊娠組與妊娠失敗組患者基線資料［（），%］

表1 正常妊娠組與妊娠失敗組患者基線資料［（），%］

組 別 例數 年齡 FSH（U／L） AMH（ng／ml） BMI（kg／m2） 不孕年限正常妊娠組 44 30．4±4．4 6．5±1．2 4．2±2．6 21．8±3．2 3．4±2．2妊娠失敗組 25 30．9±4．3 7．5±3．3 4．7±4．1 23．1±3．6 4．0±2．0組 別 例數 獲卵數 移植胚胎數 移植優胚數 囊胚數占比 Gn總量（U）正常妊娠組 44 12．2±3．7 2．0±0．4 1．9±0．6 65．52 2 264±715妊娠失敗組 25 11．8±3．8 1．8±0．6 1．8±0．5 55．56 2 564±702

二、不同時間點D－二聚體濃度變化情況

在降調日、扳機日以及驗孕日3個不同時間點抽取枸櫞酸鈉抗凝血進行D－二聚體檢測，結果顯示：D－二聚體濃度在降調日、扳機日及驗孕日分別為（280±160）ng／ml、（240±190）ng／ml、（1 100±540）ng／ml，降調日與扳機日D－二聚體濃度無顯著性差異（P＞0．05），而在驗孕日顯著上升（P＜0．001）（圖1）。

圖1 不同時間點D－二聚體濃度變化情況

三、血清E2與D－二聚體濃度之間的相關性

使用Gn促排卵后血清E2水平隨著卵泡的發育，逐漸升高。扳機日E2水平［（9 530±4 484）pmol／L］與D－二聚體濃度［（240±190）ng／ml］之間呈負相關（r＝－0．1），但無統計學意義（P＞0．05），即E2處于高水平時，血漿中D－二聚體并沒有隨之升高（圖2）。

圖2 扳機日血清E2水平與D－二聚體水平的相關性

四、扳機日D－二聚體濃度與OHSS發生的相關性

取卵個數≥20個疑似OHSS或已確診OHSS的患者與接受新鮮胚胎移植患者（取卵＜20個）在扳機日的 D－二聚體濃度［（250±220）ng／ml vs．（240±190）ng／ml］無顯著 性 差 異 （P＞0．05）（圖3）。

圖3 扳機日D－二聚體濃度與OHSS發生的相關性

五、驗孕日D－二聚體濃度與妊娠結局的相關性

驗孕日正常妊娠組D－二聚體濃度［（1 200±580）ng／ml］高于妊娠失敗組［（900±420）ng／ml］，但差異無統計學意義（P＞0．05）（圖4）。

圖4 驗孕日D－二聚體水平與妊娠結局相關性

討 論

COH過程中大劑量性激素類藥物的運用使機體受高水平雌激素刺激，血液處于高凝狀態，是導致OHSS發生的重要原因。合并有肥胖、高血壓、抗磷脂綜合征等與血栓形成相關的高危因素的患者，在COH治療過程中更容易形成血栓，因此，在IVF／ICSI治療前需對高危人群進行系統評估及診療，促排前后給予阿司匹林、低分子肝素等抗凝治療，甚至直至分娩后6周，或根據病情繼續抗凝治療，可有效預防血栓栓塞性疾病發生及改善其妊娠結局［6］。目前已有學者開始重視IVF過程中的高凝狀態，提出促排卵過程預防性使用抗凝藥物可有效降低OHSS發生率，降低妊娠后流產率，提高胚胎種植率［7－8］。孫雯等［9］提出OHSS的主要危險因素是血栓，對于血栓形成高?；颊撸杞o予預防性抗凝治療，一旦早期發現血栓栓塞，立即給予低分子肝素進行抗凝治療，提高血栓栓塞患者的預后。

那么，如何在COH治療過程中盡早發現血栓形成風險？D－二聚體是纖溶酶水解交聯蛋白所形成的降解產物之一，作為高凝狀態和內源性纖溶系統的標志物，其升高主要反應體內凝血活性增強，因此D－二聚體對高凝狀態的診斷、療效觀察和預后判斷具有重要的應用價值。但目前對于無血栓形成的高?；颊邅碚f，D－二聚體濃度對OHSS的發生以及不良妊娠結局的預測作用尚不明確，也鮮有報道。因此，本研究擬分析降調日、扳機日及驗孕日這3個時間點D－二聚體的變化，以了解促排卵前后、移植胚胎后血漿D－二聚體水平的變化，以及促排卵前后D－二聚體濃度的變化對發生OHSS和不良妊娠結局的影響，以評估D－二聚體濃度對于IVF－ET治療中患者妊娠結局的預測價值。

OHSS是COH常見的并發癥之一，由于COH過程中雙側卵巢多個卵泡發育、黃體囊腫形成和急性血管通透性增加導致不同程度胸腹水、電解質紊亂、肝腎功能損壞、血栓形成等。OHSS在輔助生殖技術治療中發生率為20%～33%。其中重度OHSS發生率為3%～8%［10］。OHSS患者機體發生凝血時，凝血酶作用于血漿纖維蛋白原（FIB），使其轉變為交聯纖維蛋白，同時纖溶系統被激活，降解交聯纖維蛋白，便產生了包含γ鏈相連的2個D片段，即D－二聚體，且可持續4周以上［11］。多數研究認為OHSS的發生與雌激素水平相關，但近年來，有學者提出取卵數對OHSS發生的預測價值更大。Magnusson等［12］研究指出取卵個數20個以上時OHSS及血栓事件發生率顯著升高，但是否需要使用抗凝藥物進行治療，尚不明確。本研究結果顯示，取卵≥20個的患者與取卵＜20個的患者比較，取卵≥20個組扳機日血漿D－二聚體濃度略高，但差異無統計學意義，提示促排后D－二聚體濃度可能不是預測OHSS發生的指標。

國內外研究發現，COH過程中超生理劑量的性激素類藥物的運用以及多個卵泡發育引起體內雌激素水平的升高，可能是影響胚胎種植和進一步發育的因素［7］。其作用機理，有學者認為高凝傾向可促使胚胎種植部位微血栓形成，影響合體滋養層細胞侵襲而 影 響 胚 胎 種 植［7，13－14］。另 外，過 高 雌 激 素 也可影響母體的凝血功能，母體血管血栓形成致絨毛間隙血流減少而導致反復流產的發生［15］。近年來大量數據顯示妊娠期高凝狀態引起的微循環障礙與反復流產、胎兒宮內生長受限密切相關。Giardina等［16］研究發現，正常月經周期增生期階段D－二聚體隨著雌激素升高而升高；Rogolino等［17］研究指出COH過程中D－二聚體隨著雌激素水平升高而升高，結果顯示D－二聚體可提示COH處于高凝狀態，對血栓形成、胚胎種植有著重要的預測作用。張莉莉等［18］檢測IVF－ET后7d血漿 D－二聚體水平，指出鮮胚移植周期由于超促排卵導致血清雌激素升高，血液高凝狀態，纖溶亢進，血漿D－二聚體升高，胚胎發育可能受負面影響導致流產率升高。治療方面，有學者提出肝素可降低COH血栓形成風險，還可促進滋養層細胞侵入內膜，提高妊娠率［19－20］。然而，莫美蘭等［4］研究發現反復種植失敗患者妊娠后至12周內D－二聚體水平在自然流產組與成功分娩組中無顯著性差異。本研究中發現，COH過程中隨著雌激素水平的升高，D－二聚體濃度并沒有顯著升高，說明促排卵后雌二醇的升高，并不是導致D－二聚體升高的主要原因，本研究結果與上述研究結果不一致。而驗孕日D－二聚體濃度較降調日、扳機日顯著升高，即取卵術后2周，D－二聚體顯著升高，未排除穿刺卵泡后傷口修復激活凝血系統，同時纖溶系統亦被激活而代謝出D－二聚體。另外，正常妊娠與妊娠失敗患者驗孕日D－二聚體濃度無顯著性差異，表明驗孕日D－二聚體濃度未能預測IVF－ET患者妊娠結局。本研究未針對不孕癥患者妊娠后至12周之內的D－二聚體水平進行監測，故未能進一步分析早期流產與繼續妊娠患者之間D－二聚體水平的情況，此為本文不足之處。

綜上所述，血漿中D－二聚體濃度并不足以評估COH過程中高凝狀態，本研究中發現扳機日或驗孕日D－二聚體水平對無血栓形成高危因素的不孕癥患者發生OHSS及不良妊娠結局無預測作用。因此，對于COH過程中高凝狀態的準確評估，可能需要同時監測多個凝血或纖溶指標，臨床醫生更要結合臨床，不能僅憑D－二聚體水平判斷患者的預后轉歸。