外周血CD3＋T淋巴細胞對習慣性流產患者不良妊娠的預測價值

李慧，廖碧翎，林小紅

（廣東省婦幼保健院婦產科，廣州 510010）

習慣性流產（RPL）是指婦女與同一性伴侶發生連續3次以上的妊娠胚胎丟失。RPL發生率為1%～5%［1］，已成為臨床上最常見的不育癥之一；其治療難度大，給產婦和家庭帶來極大的身心傷害。RPL的發病機制非常復雜，可能的誘因包括子宮畸形、遺傳因素、免疫異常、感染等［2］。最新研究表明，T淋巴細胞介導的母胎界面免疫異?？赡芘cRPL的發生有關［3］。妊娠狀態類似于同種異體移植過程［4］，母胎界面的免疫耐受使胚胎不被母體排斥；當免疫耐受破壞后，母體對胚胎產生排斥反應，最終導致流產。T淋巴細胞是一組來源于骨髓的多功能干細胞，按照表面CD抗原分為不同的亞群；其中CD3＋T細胞幾乎存在于所有T細胞表面，是成熟T細胞的主要標記物［5］。研究表明，RPL患者外周血CD3＋細胞明顯高于正常孕婦，正常孕婦孕前CD3＋細胞水平升高是孕期流產的高危險因素［6－7］。本研究通過分析RPL再次受孕患者和正常孕婦早孕期CD3＋細胞水平的差異，并隨訪妊娠結局，旨在評價CD3＋細胞對RPL患者不良妊娠的預測價值。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年12月至2018年10月就診于我院婦產科的RPL再次妊娠早孕期患者60例為研究對象，年齡20～36（28．5±3．9）歲。納入標準：本次受孕前發生3次以上自然流產的育齡婦女，患者及配偶間無染色體異常，患者性伴侶精液檢查正常。排除標準：生殖道畸形，內分泌疾病，血小板增多癥或血栓前狀態，自身免疫性疾病，全身或局部感染，陰道霉菌、衣原體、支原體或滴蟲陽性，異位妊娠，生化妊娠，妊娠滋養細胞疾病。

選擇同期于我院常規產檢的無既往自然流產史正常早孕婦女50例為對照組，年齡20～39（28．6±4．7）歲。研究對象均經血HCG、B超檢查證實本次妊娠。本研究經我院醫學倫理委員會批準，研究前征得所有孕婦同意，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1．研究試劑與儀器：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD3單克隆抗體、別藻藍蛋白（APC）標記的小鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標記的小鼠抗人CD8單克隆抗體均購自丹科醫療器械技術服務（上海）有限公司；FACSAria II流式細胞儀（BD，美國）；溶血素、肝素抗凝管（BD，美國）。

2．樣本采集：兩組患者均于早孕期抽取新鮮外周血1ml，RPL組抽血時停經時間39～68（53．6±5．6）d，對照組為39～74（54．6±7．5）d。血液樣本采集后置于肝素抗凝管，輕輕混勻3～5次，貼上相應標簽，常溫送檢。

3．流式細胞儀檢測外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細胞數量：取50μl外周血，分別加入10μl FITC－CD3單克隆抗體、10μl APC－CD4單克隆抗體和10μl PE－CD8單克隆抗體，避光反應20min。加入1ml溶血素，避光反應20min，2 500rpm離心5min，棄去上清液。加入200μl磷酸鹽緩沖液輕輕振蕩混勻，2 500rpm離心5min，棄去上清液，載入加入200μl磷酸鹽緩沖液。利用流式細胞儀檢測CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細胞數量，檢測操作參考儀器及試劑盒說明書。

4．資料收集與隨訪：記錄RPL組和對照組年齡、體重指數（BMI）、孕次、產次、停經時間以及外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細胞數量。隨訪孕婦妊娠結局，按照是否成功分娩分為RPL成功分娩組（24例）、RPL再次流產組（36例）和正常成功分娩組（48例），分析影響RPL再次流產的危險因素。

三、統計學方法

采用SPSS 19．0軟件處理數據。計數資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。采用Logistic回歸模型分析影響RPL患者不良妊娠的獨立危險因素。利用受試者工作曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）評價CD3＋T細胞對RPL患者不良妊娠的預測價值。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、隨訪結果

RPL組患者中24例成功分娩，36例再次流產；對照組1例失訪，1例自然流產，其余48例成功分娩。3組間年齡、BMI、產次、采血時停經時間等一般資料比較均無統計學差異（P＞0．05），RPL再次流產組、RPL成功分娩組孕次顯著高于正常成功分娩組（P＜0．001）（表1）。

表1 各組一般資料比較（）

表1 各組一般資料比較（）

注：與正常成功分娩組比較，＊P＜0．001

組 別 例數 年齡 BMI（kg／m2） 孕次 產次 停經時間（d）RPL再次流產組 24 28．1±3．9 21．44±2．33 3．22±0．42＊ 0．11±0．32 53．0±5．7 RPL成功分娩組 36 29．2±3．9 22．05±2．31 3．17±0．48＊ 0．13±0．34 54．5±5．4正常成功分娩組 48 28．7±4．8 21．12±1．84 0．19±0．39 0．19±0．39 54．8±7．6

二、3組孕婦外周血免疫細胞比值比較

RPL再次流產組外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T細胞比值顯著高于RPL成功分娩組和正常成功分娩組（P＜0．05）；RPL成功分娩組外周血CD3＋T細胞比值顯著高于正常成功分娩組（P＜0．05），但兩組間CD3＋CD4＋T細胞比值差異無統計學意義（P＞0．05）；3組間CD3＋CD8＋T細胞比值相比較，差異無統計學意義（P＞0．05）（圖1、2）。

圖1 各組孕婦外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T細胞比值比較

圖2 孕婦CD3＋流式檢測散點圖

三、RPL再次流產危險因素分析

單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，CD3＋、CD3＋CD4＋T細胞是影響RPL患者再次流產的獨立危險因素（均P＜0．05）（表2、3）。

四、CD3＋T細胞預測RPL患者再次流產的ROC曲線

CD3＋T細胞臨界值為79．02%時，預測RPL患者再次流產的AUC為0．836［95%CI（0．717，0．919）］，顯著高于CD3＋CD4＋T細胞［AUC＝0．630，95%CI（0．495，0．751）］（Z＝2．432，P＝0．015），對應的特異性為91．7%，敏感性為63．9%（圖3）。

表2 RPL 再次流產危險因素賦值

表3 RPL再次流產危險因素Logistic回歸分析

圖3 CD3＋和CD3＋CD4＋T細胞預測RPL患者再次流產的ROC曲線

討 論

生理妊娠類似于同種異體移植，整個妊娠過程即是母體對胚胎免疫耐受的過程。正常情況下，胚胎作為同種異體移植物，可以存活至分娩結束。在妊娠的任何階段，母體自身免疫功能發生改變，會破壞母體和胚胎之間的免疫耐受平衡，導致胚胎移植失敗而發生流產［8］。T淋巴細胞是機體重要的免疫調節細胞，在機體體液免疫中發揮重要作用。研究表明，T淋巴細胞與生殖免疫有關，T淋巴細胞亞群的平衡對正常妊娠有著重要作用，一旦平衡被打破，即可引起母胎之間免疫失衡，最終導致妊娠失?。?］。

T淋巴細胞介導的生殖免疫機制較為復雜，目前已知妊娠母體的胚胎基因有一半來自于父系；由于胚胎細胞表達了異體抗原，使母胎之間發生免疫排斥，因此母體需要發生免疫耐受才能避免胚胎被母體排斥，從而維持正常妊娠過程［10］。T淋巴細胞介導了由胚胎誘導的母胎天然免疫反應，CD3＋幾乎表達于所有成熟T細胞表面，是T細胞的主要表面標志。既往研究表明，CD3＋T細胞產生的細胞因子可以直接影響滋養細胞的分化和增殖，從而影響胚胎的發育［11］。此外，CD3＋T細胞還可能通過血小板活化和血栓形成，誘發血栓性事件而導致妊娠失?。?2］。本研究顯示，無論是否成功分娩，RPL患者外周血CD3＋T細胞明顯高于正常成功分娩組，并且RPL再次流產組外周血CD3＋T細胞明顯高于RPL成功分娩組，提示CD3＋T細胞升高可能與RPL發生和RPL不良妊娠結局有關。

研究表明，伴胰島素抵抗的RPL患者外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T細胞水平明顯升高，且CD4＋T細胞異常的患者更容易發生反復自然流產［12－13］。Wang等［14］稱孕婦CD4＋T細胞增多時，會增強母體對胚胎的免疫排斥反應，而CD8＋T細胞會抑制CD4＋T細胞介導的細胞免疫，因此CD4＋／CD8＋T比值穩定對維持正常妊娠起著重要作用。Kwiatek等［15］研究顯示CD3＋CD4＋T細胞升高可以增強母體的免疫功能，導致母胎排斥反應而誘發流產。在正常妊娠過程中，CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比值（Th／Ts）保持動態平衡，從而維持正常妊娠［16］。本研究發現，RPL再次流產組外周血CD3＋CD4＋T細胞明顯高于RPL成功分娩組和正常成功分娩組，但是3組CD3＋CD8＋T細胞差異無統計學意義，提示CD3＋CD4＋T細胞升高可能與RPL不良妊娠有關，而CD3＋CD8＋T細胞與RPL患者妊娠結局無關。目前關于CD3＋CD8＋T細胞對妊娠結局的影響爭議較大，梁仲城等［17］稱反復流產患者明確存在外周血中T細胞、NK細胞、CD4／CD8含量分布及T細胞CD4CD25異常表達。Grimstad等［18］則在研究中發現流產和成功分娩的反復自然流產患者在妊娠早期CD3＋CD8＋無明顯變化。CD3＋CD8＋在RPL患者分娩結局中的作用仍需要進一步研究。

本研究采用多因素回歸分析影響RPL患者再次流產的危險因素，結果顯示CD3＋、CD3＋CD4＋T細胞是影響RPL患者再次流產的獨立危險因素。ROC分析顯示CD3＋T細胞預測RPL不良妊娠結局的AUC顯著高于CD3＋CD4＋T細胞（0．836vs．0．630），其臨界值為79．02%，說明妊娠早期CD3＋T細胞高于79．02%的RPL患者再次流產的風險明顯升高。Talukdar等［19］報道稱孕婦妊娠前高CD3＋T細胞水平是妊娠后流產的危險因素。Du等［20］認為無論妊娠結局如何，孕婦妊娠后外周血CD3＋T細胞明顯高于妊娠前，提示CD3＋T細胞與妊娠過程有關。本研究由于受試對象入選時間原因，未分析RPL患者妊娠前后血清CD3＋T細胞變化情況，在接下來的研究中我們也將在這方面做一些深入探討。

綜上所述，RPL患者再次妊娠早孕期檢測外周血CD3＋T細胞將有助于預測患者妊娠結局。