酵母菌高糖脅迫機制的研究進展

雷夢琳 ，李湘鑾，白衛東*，趙文紅，劉功良，郭 波，黃文彪

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.廣東石灣酒廠集團有限公司，廣東佛山 528031；3.佛山市海天（高明）調味食品有限公司，廣東佛山 528511）

耐高糖酵母是一種在高糖環境中能生長、發酵產生乙醇和二氧化碳的真菌，其轉化能力強，發酵效率高，能適應高滲的惡劣環境[1-3]。在高糖脅迫下，細胞內也會產生過量的活性氧和活性氮等，這些有害物質的產生使一氧化氮合酶被激活，進而生成過氧亞硝基，過氧亞硝基會破壞機體，使細胞損傷[4]。隨著發酵的進行，常能發現胞內物質的組成會發生改變，水分活度的改變會使細胞膜破裂，也抑制了細胞內相關酶的活性，這對酵母發酵有不利影響，不僅使酵母生長延緩，還會降低其發酵效率和發酵產量。這是由于酵母在發酵初期處于一個高糖的環境，在高糖環境下發酵會不斷產生乙醇，壓力不斷增大，導致對細胞的毒害作用增強[5-6]，使酵母獲得高糖耐受力，對減少高糖環境中對酵母生長的不利因素、降低對細胞的毒害作用和提高酵母發酵效率具有重要意義。

本文對耐高糖酵母進行代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學和基因組學研究，更深刻了解耐高糖酵母的脅迫機制，對定向改造酵母菌的性能和釀酒工業具有重要意義。

1 耐高糖酵母的篩選

1.1 自然篩選

菌種在自然環境條件下，不需要人為手段改造而通過長時間的變異、進化，從而改變自身性能來適應不斷變化的環境，得到人們想要具有某種性能的菌株就是自然篩選。自然篩選的一般步驟是先尋找初始菌株，再對初始菌株進行培養，富集到一定程度后分離菌種，最后鑒定是否具有研究所需的某種性能[7]。

杜鵑等[8-9]從東北椴樹蜜發現一株耐高糖酵母，富集后進行分離得到酵母菌YMI-37，對其進行生理形態分析、基因組測序等發現酵母菌YMI-37為酵母菌屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。該酵母能適應80%高糖濃度的環境，測得其初始發酵速度快，發酵效率高。LIU G L等[10]在17個陳舊蜂蜜樣品中，富集培養后分離純化得到了6株蜂蜜接合酵母，均屬于耐高糖酵母菌。邱巨香等[11]經過對中蜂蜜和意蜂蜜的分離、純化、菌種鑒定，結果顯示，中蜂蜜和意蜂蜜中的耐高糖酵母都是魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）。吳啟鳳等[12]從貴州水晶葡萄中分離純化后得到性能較優的菌株SJJM-7和SJJM-18，對這兩株菌株的性能進行研究，發現在50%的高糖模擬葡萄汁培養基中檢出菌株SJJM-7和SJJM-18，說明這兩株菌株均具有耐高糖性能。目前，自然篩選的耐高糖酵母菌株大多數來自高濃度糖環境如蜂蜜、果汁、甘蔗、高糖果酒等，能在高糖環境下存活的酵母一般具有耐高糖性能。

1.2 誘變育種

誘變育種是一種現代育種技術，它利用物理、化學因素對動植物進行處理，誘導其遺傳特性發生突變，再從發生突變的樣品中選擇符合人們意愿的菌株，對其進行進一步富集培養獲得新品種或種質的育種方法。誘變育種的一般步驟：自然篩選→富集培養菌種分離→菌種純化→人工誘變→逐級篩選→性能鑒定[13]。根據誘變的方式，可分成紫外線誘變和自然馴化。

1.2.1 紫外線誘變

紫外線誘變法是一種被大多數人認可的誘變育種方法，該方法對酵母菌先進行分離篩選后再誘變，其操作方便，容易使酵母菌發生正突變。陳英[14]對野生釀酒酵母菌株MF02進行紫外誘變，將發生突變的菌株涂布到YP40培養基中，將1株來自30 s誘變時間突變體庫的菌株和1株來自45 s誘變時間突變體庫的菌株一同放在50 mL的YP40培養基中發酵，測其生長曲線和酒精含量，發現來自30 s突變體庫的突變菌株UV02_HG性能較優，其在40%葡萄糖壓力下仍能快速生長、高速發酵。徐日益等[15]以釀酒酵母AS2.1189為初始菌株，對其進行紫外誘變，誘變到100代后得到兩株菌株B2和A17，均能適應高滲環境。潘慧麗等[16]以蜂蜜、葡萄、面包3種原料進行酵母菌富集菌株，通過梯度馴化與紫外誘變相結合的手段選育耐高糖且發酵特性優良的酵母菌株，最終獲得具有耐高糖性能的酵母菌株FM-1.1-40，其最大耐受糖度為40%。

1.2.2 自然馴化

自然馴化是可操作性強，方向性明確的篩選方法。熊雅蘭等[17]通過對野生型甘蔗糖蜜發酵高產乙醇菌株MF1002的呼吸突變菌株MF15C進行馴化，發現菌株MF15C比MF1002更加適應高糖環境。黃星源等[18]對青梅酒酵母S05進行耐高糖馴化中，在總糖為200～300 g/L青梅清汁中都能在9～19 h較快啟動發酵，發酵第15天時，酒精度可以達到16.8%vol，殘糖含量為3.5 g/L。

1.3 基因工程育種

誘變育種的篩選工作量大，突變具有不穩定性和多樣性，效率較低。隨著基因技術的發展，基因工程育種漸漸成為常見的篩選方法，該方法可操作性強，目的明確。基因工程育種是將目的基因導入受體細胞，對菌種進行改造獲得人們意愿的性能。

沈玉平[19]通過在god基因前端插入α-淀粉酶信號肽序列，α-淀粉酶信號能在胞外分泌，插入目的基因后酶能夠高效分泌到胞外，酶活性發生改變，從而得到能在高糖環境，高溫條件下發酵的菌株。張曉陽等[20]通過代謝工程與全基因組重組得到了抗逆高產乙醇的釀酒酵母。王立光等[21]利用同源重組法得到了NHX1基因缺失突變株，對NHX1基因的逆境脅迫性能進行研究，發現NHX1基因是重要的離子反向轉運體，缺失NHX1基因會使釀酒酵母BJ3505的抗逆性降低。

2 高糖脅迫應激代謝特性

隨著釀酒技術的進步和釀酒工業的發展，國內外對耐高糖酵母的代謝途徑和代謝產物已有較多研究成果，大多數認為細胞通過主動調節甘油、海藻糖等物質的分泌量來應對高糖環境。由于其代謝途徑的復雜性和代謝產物的多樣性，目前國內外對于耐高糖酵母具體的代謝特性和應答機制還有待進一步研究。

蜂蜜接合酵母6-7431對營養物質的代謝能力較強，劉功良等[22]研究其在高糖脅迫下的應激代謝產物，發現在高糖環境下釀酒酵母甘油的分泌量會增加，在不超過700 g/L糖質量濃度的環境中可以調節滲透壓，可能是在高糖脅迫下由于在此范圍內合成甘油的基因和海藻糖合成基因的表達量增加所致[23]。海藻糖是耐高糖酵母發酵過程中的一種生物相容性溶質，細胞通過主動調節海藻糖分泌量來適應高糖環境，保護其免受高糖脅迫環境對細胞的細胞膜、蛋白質、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等大分子物質的破壞[24-25]。甘油是耐高糖酵母發酵過程中的一種典型的應激代謝產物，甘油內的羥基使其具有良好的親水性，能有效調節細胞滲透壓，保護細胞免受因滲透壓的改變而導致細胞的破壞[26-27]。三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）代謝中間產物對酵母在高糖環境下應激反應具有重要的影響，糖酵解和磷酸戊糖途徑中相關酶蛋白增加[28]，導致乙酰輔酶A更多地進入到TCA中。在高糖環境中，釀酒酵母在發酵過程中由于TCA中斷，有氧呼吸受到抑制，不斷積累的α-酮戊二酸和蘋果酸等TCA中間產物會降低發酵效率[29]。

時桂芹等[30]以釀酒酵母為模型，對不同葡萄糖濃度的四組釀酒酵母細胞（20 g/L葡萄糖組、40 g/L葡萄糖組、60 g/L葡萄糖組和80 g/L葡萄糖組）培養4～8 h，隨著環境脅迫的進行，海藻糖積累量先升高后下降，海藻糖積累量最高點出現在8 h。在不同葡萄糖濃度脅迫下，酵母細胞胞內外甘油的積累隨著時間增加呈現出先上升后下降的趨勢，但是胞內甘油的積累量在80 g/L葡萄糖質量濃度時達到最高，而胞外甘油的積累量在60 g/L葡萄糖質量濃度時達到最高。這些結果進一步驗證了在高糖脅迫下甘油和海藻糖是釀酒酵母的主要相容性溶質。當釀酒酵母在葡萄糖含量達到80 g/L的高糖環境時，酵母生長緩慢，細胞出現高糖脅迫，此時細胞內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性均顯著增高（P＜0.05），說明細胞通過調節這些抗氧化物酶的活性來維持細胞正常的滲透壓。耐高糖酵母代謝過程中與不同酶的活性有著密不可分的聯系，酶類是細胞內氧化反應的重要物質，將代謝應激物和酶類聯系在一起，在TCA、糖酵解和磷酸戊糖途徑等代謝途徑中檢測酶活力和代謝產物的種類、含量和代謝特性，建立清晰的代謝網絡以便更深刻地認識酵母耐高糖應激機制。

3 酵母菌耐受高糖機制的轉錄組學和蛋白質組學研究

酵母菌耐受高糖機制與胞內轉錄因子的表達和蛋白質的合成有著復雜的調控關系，目前轉錄組學和蛋白質組學在酵母耐受高糖機制上的應用越來越熱門，主要是通過對不同生長階段耐高糖酵母菌轉錄組的測序和蛋白質合成來研究與其有關的轉錄因子和蛋白質，從而綜合分析進一步了解具體的酵母耐受機制。陳英[14]對40%葡萄糖壓力下菌株MF02和UV02_HG的表達差異基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集，發現在高糖壓力下兩菌株間的表達差異主要集中在核糖體、氧化磷酸化、內質網蛋白加工過程、硫胺素代謝、吞噬體和胞吞作用、蛋白輸出、糖代謝途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。

3.1 從轉錄水平研究酵母耐受高糖機制

吳靜等[31]研究發現，光滑球擬酵母（Candida glabrata）的基因CgASG1缺失會降低對氧化脅迫和高滲脅迫的抵御能力。此前研究了缺失CgASG1基因對光滑球擬酵母轉錄組水平的影響，C.glabrata中的轉錄因子Asg1p能維持生物魯棒性，但其不參與細胞利用非發酵性碳源這個過程，缺失基因CgASG1光滑球擬酵母對高酸的耐受力較弱。這是因為在高酸環境下ATPase活性相關基因的轉錄發生了改變，細胞胞內質子數量增加，酸性增強導致胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高[32]，進一步影響了胞內的代謝系統[33]，氧化還原相關基因轉錄水平的變化影響胞內氧化還原電勢，進而改變細胞生長[34]。葉美玲[35]對南極酵母AN5不用銅離子處理和銅離子處理的兩組酵母菌進行轉錄組的測序，整理分析測序數據后，找出相關差異基因，對其進行功能分析。檢測南極酵母AN5在重金屬脅迫下基因表達上調或下調是否明顯，并從差異基因中找到可能起明顯作用的三個基因，再設置實驗進一步驗證。結果表明在銅離子脅迫下，基因GST和WD重復蛋白的表達量有所上調，推測這兩個基因可能與酵母菌耐受機制有關。

3.2 從蛋白質水平研究酵母耐受高糖機制

陳英[14]對突變菌株的耐高糖性研究發現內質網蛋白加工過程途徑上的分子伴侶基因SSA1（+2.4）、SSA3（+3.7）、SSA4（+2.3）、SSB2（+1.8）、SCJ1（+2.4）、HSP42（+2.3）、CNE1（+1.8）和PDI1（+2.0）全部表達上調。在細胞質和內質網中的熱激蛋白負責蛋白折疊和分泌，作為分子伴侶參與細胞多種壓力的應激[36]。鈣網蛋白（CNE1）在內質網內膜上，作為分子伴侶參與糖蛋白合成和蛋白折疊[37-38]。可見突變菌株的耐高糖性狀和蛋白質加工中的分子伴侶有著密切聯系。

田一雄等[39]采用二維電泳技術對脈沖電場處理前后哈密瓜汁中釀酒酵母蛋白質進行檢測分析，發現釀酒酵母中硫氧還蛋白過氧化物酶表達上調，細胞的自我防御需要該酶的調節，說明脈沖電場（pulsed electric field，PEF）處理過程中釀酒酵母細胞啟動代謝調控來應對環境的變化。延長因子2也發生了表達上調，該因子在蛋白質合成過程中起到重要作用，說明經PEF處理，釀酒酵母細胞為適應環境的變化，細胞需要更多的蛋白質。

4 酵母菌耐受高糖機制的基因組學研究

耐高糖酵母的基因耐受機制近年來備受學者關注，隨著基因技術的發展，關于酵母基因耐高糖機制可以通過DNA提取，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，比對基因庫等對其進行基因測序，找出與其相關的基因，通過敲除這些基因，與未敲除的對照組進行對比，研究其在高糖環境下的發酵性能，檢測基因表達水平等來進一步驗證耐高糖酵母的作用基團。

4.1 GPD2、SUC2和HXT1基因表達水平對高糖脅迫下槲皮素處理酵母的影響

徐曉丹等[40]以釀酒酵母S288c為模型，分析高糖脅迫下槲皮素對其胞內損傷的保護作用及機制。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母S288c中GPD2基因表達量相對對照組下降了45.30%，SUC2基因表達量相對對照組下降了51.30%，而HXT1基因相對表達量比對照增加了7.54倍，GUT1基因相對表達量與對照組相比基本持平。可見高糖脅迫下用槲皮素處理，GPD2和SUC2基因的表達會受到抑制，HXT1基因表達上調，所以GPD2、SUC2和HXT1基因的表達水平上調能提高釀酒酵母S288c的發酵效率。

4.2 敲除STE12、TUP1基因后對突變菌株UV02_HG的影響

陳英[14]對突變菌株UV02_HG中敲除STE12基因后，敲除菌株的細胞膜通透性降低，但其較菌株UV02_HG更能適應高糖環境。基因回補表達后菌株細胞膜對蛋白質的透性有所增強，由此判斷STE12基因可能與細胞膜對蛋白質的通透性有關，從而進一步調控自身適應高糖環境。而基因TUP1缺失后，菌株UV02_HGΔTUP1與菌株UV02_HG相比，在酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基中生長緩慢，相對呼吸強度較弱，基因回補表達的菌株UV02_HGΔTUP1在YPD培養基中的生長和相對呼吸強度都有所恢復。推測TUP1基因參與調控細胞呼吸相關的基因來維持酵母細胞的正常生長，菌株UV02_HGΔTUP1對高糖的耐受能力増強，由此推斷TUP1基因缺失后，細胞的呼吸作用削弱，通過對糖類物質的利用改變細胞膜透性，從而使細胞具有高糖耐受性。

4.3 GPD2基因和tdcD基因對酵母的影響

工業釀酒酵母中GPD2基因與甘油合成途徑密切相關，黃廣慶[41]用工業釀酒酵母AS2.489為起始菌株，敲除GPD2基因，再通過單倍體融合來得到二倍體的GPD2基因缺失菌。用20 g/L的葡萄糖進行搖瓶發酵實驗，發現敲除GPD2基因后的缺失菌株與起始菌株相比，甘油含量和乙酸含量都有一定程度的下降，乙醇含量有所提高。推測GPD2基因與合成甘油途徑相關，合成甘油途徑的受阻會進一步影響發酵速率和發酵周期。孟剛等[42]為控制乙酸溢流，在乙酸代謝途徑中敲除了丙酸激酶編碼基因tdcD，該基因具有乙酸激酶活性。通過設置“微糖”和“高糖”兩個發酵環境的兩個實驗組，檢測在不同糖濃度條件下乙酸含量的變化和對酵母菌的影響。發現敲除了tdcD基因的酵母菌在高糖環境下，在對數生長后期依然發酵旺盛，產酸效率高，色氨酸產量較對照組高，而產乙酸量較對照組低，推測tdcD基因與酵母菌高糖耐受機制有一定相關性。

5 結論與展望

隨著分子生物學與基因工程的迅速發展[43]，越來越多學者從代謝組學、基因組學、轉錄組學和蛋白質組學來研究酵母菌高糖耐受機制。代謝組學上，可以檢測耐高糖菌株的代謝應激產物和與代謝途徑相關的酶類，了解其代謝途徑和生理特性，建立清晰的代謝網絡。基因組學上，可以對表型差異大的菌株進行高糖脅迫處理，跟蹤脅迫前后相關基因的表達，深入研究其表達特性，找到耐受機制的關鍵基因，對定向改造酵母菌具有重大意義。轉錄組學上，可以通過對相關基因的敲除菌株和回補菌株進行研究，找到轉錄因子對耐受機制的影響。蛋白質組學上，可以通過對重要酶類進行研究，進一步揭示耐高糖酵母的蛋白合成。