袋料種植淮山藥根際土壤細菌多樣性的高通量測序分析

勞承英 韋本輝 周靈芝 申章佑 李艷英 胡泊 黃渝嵐 周佳

摘要：【目的】比較淮山藥袋料種植方法與常規(guī)定向結薯種植方法的根際土壤微生物種群多樣性，為利用微生物多樣性指導淮山藥袋料種植提供科學依據(jù)。【方法】采集常規(guī)淮山藥定向結薯種植的根際土壤樣品（記為CK3）和袋料種植的根際土壤樣品（記為A3），對土壤樣品中細菌的16S rDNA序列V4高變區(qū)進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行高通量測序，分析土壤樣品中細菌群落的多樣性及其分布規(guī)律。【結果】CK3的pH為6.21，有機質(zhì)含量為32.2 g/kg;A3的pH為5.98，有機質(zhì)含量為30.0 g/kg。2種不同種植方法下淮山根際土壤樣品中共檢測出細菌41門100綱147目292科530屬。淮山藥根際土壤細菌在門水平上的主要優(yōu)勢類群有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）;在綱水平上的主要優(yōu)勢類群有α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、放線菌綱（unidentified-Actinobacteria）和δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）等。在門和綱分類水平上，2種種植方法淮山藥根際土壤樣品中細菌的優(yōu)勢菌群相似，相對豐度差異不顯著（P>0.05），CK3的細菌多樣性高于A3。【結論】淮山藥袋料種植方法可行，可在旱坡地和石山地等非耕地應用。

關鍵詞： 淮山藥;袋料種植;根際土壤;細菌多樣性;高通量測序

中圖分類號： S632.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2367-07

High-throughput sequencing analysis of rhizosphere soil bacterial diversity of yam planting in bag material

LAO Cheng-ying， WEI Ben-hui， ZHOU Ling-zhi， SHEN Zhang-you，

LI Yan-ying， HU Po， HUANG Yu-lan， ZHOU Jia*

（Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】The microbial population diversity in rhizosphere soil between bag material and conventional orientation in yam planting was compared in order to provide scientific basis on the utilization of soil microbial diversity to plant yam in bag material. 【Method】Rhizosphere soil samples from conventional orientation planting method of yam（marked as CK3） and from bag material planting method of yam（marked as A3） were collected in the field. The 16S rDNA sequence V4 high-variable region of rhizosphere soil bacteria in two kinds of different planting methods were amplified by PCR，and then the products of PCR amplification were sequenced with high throughput to analyze the diversity and distribution of bacterial community in soil. 【Result】The pH value of CK3 sample was 6.21，organic matter content was 32.2 g/kg;the pH value of A3 was 5.98，organic matter content was 30.0 g/kg. A total of 530 genera，292 families，147 orders，100 classes and 41 phyla of bacteria were detected in the two soil samples. The advantage groups in rhizosphere soils of yam were Proteobacteria，Acidobacteria，Actinobacteria，Chloroflexi and Gemmatimonadetes on the phylum level. The advantage groups in rhizosphere soils of yam were Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Betaproteobacteria，unidentified-Actinobacteria and Deltaproteobacteria on the class level. The structure and composition of bacterial community in rhizosphere soil samples of different planting methods were similar， the relative abundance of the different planting methods had not significant difference on the phylum and class level（P>0.05）. Bacterial diversity of CK3 was higher than that of A3. 【Conclusion】The bag material planting method of yam is feasible， and can be applied in uncultivated areas such as dry slope land and stony hillside.

Key words： yam; bag material planting method; rhizosphere soil; bacteria diversity; high throughput sequencing

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860347）; Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA281012）; Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke2017JM21）

0 引言

【研究意義】淮山藥（Dioscorea opposita Thunb.）隸屬于薯蕷科薯蕷屬，為一年生或多年生單子葉纏繞性藤本植物，可食用部分為肥厚的塊莖，藥食同源（Hsu et al.，2003），是美味滋補的佳肴，具有較好的經(jīng)濟價值和市場前景（趙令敏等，2019）。但淮山藥莖塊多數(shù)是在疏松的土壤條件下垂直向下生長，種植和采收均需挖深溝，耗時費力（韋本輝，2013）。為降低種植和采收難度，減少種植和收獲成本，韋本輝等（2005）發(fā)明了淮山定向結薯栽培方法，該方法種植的淮山藥商品薯率高，可促進淮山藥產(chǎn)量增加、品質(zhì)改善，并可較大幅度節(jié)約人工和成本投入。目前，該方法已在南方淮山藥產(chǎn)區(qū)大面積推廣使用。淮山藥袋料種植方法是韋本輝等（2016）在定向結薯栽培方法基礎上的另一種創(chuàng)新，該方法能按照品種、種植密度和生態(tài)區(qū)域的不同，設計不同規(guī)格的袋料，在袋料上種植淮山藥，并獲得產(chǎn)量。土壤微生物可作為土壤肥力的重要衡量指標，對維持土壤生態(tài)功能起到重要作用（Nannipieri et al.，2003），同時也是評價土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力水平的重要指標（Kennedy and Smith，1995），因而袋料的肥力狀況可通過袋料中土壤微生物進行評價。研究表明，影響土壤微生物種群結構和多樣性的因素有多種，可分為自然因素和人為因素兩大類。自然因素包括土壤類型、植被類型、溫度、濕度和pH等;人為因素包括施肥、除草、農(nóng)藥施用、間套種等人類對土壤的管理利用（趙柏霞，2012）。不同的土壤處理方式、土地耕作方法和管理方式等對土壤微生物多樣性的影響不同，Sun等（2004）對6個農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的土壤進行施用有機肥、化肥和石灰等處理的研究，以未經(jīng)處理的土壤微生物群落為對照，施用有機肥的土壤微生物群落多樣性與對照相似，施用石灰對微生物群落多樣性的影響較小，但施用化肥的土壤微生物群落多樣性與對照存在明顯差異。傳統(tǒng)耕作土壤中細菌的數(shù)量和多樣性均低于免耕土壤，耕作可顯著降低土壤中的細菌多樣性，且對非根際土壤中細菌的影響比對根際土壤中細菌的影響更顯著（Lupwayi et al.，1998）。淮山藥袋料種植方法通過人為鋪設的塑料膜，為淮山藥的生長發(fā)育創(chuàng)造了一個與常規(guī)方式（淮山藥定向結薯種植方法）相對不一樣的半封閉環(huán)境，這種土壤環(huán)境的改變，對土壤微生物的生長生存造成一定影響。因此，探討淮山藥袋料種植方法和定向種植方法下淮山藥根際土壤酸度、有機質(zhì)含量及微生物的種群多樣性，對拓寬淮山藥的種植用地范圍，避免與主要糧食作物搶占耕地具有重要意義。【前人研究進展】高通量測序技術具有可全面、準確獲得微生物群落結構信息的特點，已廣泛應用于微生物研究中（趙帥等，2016;戴雅婷等，2017;李巖等，2018;任天寶等，2018）。劉元等（2018）采用高通量測序技術分別對懷山藥和菜山藥根莖中的內(nèi)生細菌16S rDNA V4區(qū)域進行擴增和測序，結果顯示懷山藥內(nèi)生菌多樣性大于菜山藥，懷山藥和菜山藥根莖中的優(yōu)勢菌屬均為狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto 1）。康捷等（2019）應用高通量測序技術對麻山藥在苗期、花期和收獲期時根際土壤微生物群落結構變化進行研究，結果表明細菌多樣性和豐富度在麻山藥不同生長時期內(nèi)變化不顯著，麻山藥根際細菌群落的最優(yōu)勢菌群是變形菌門和酸桿菌門。雷鋒杰等（2019）使用第二代高通量測序技術分析野生撫育模式、農(nóng)田栽參模式和伐林栽參模式3種不同栽培模式下人參根部內(nèi)生細菌和真菌的豐度和多樣性，結果顯示野生撫育模式下人參根部內(nèi)生細菌和真菌的Chao1、ACE和Shannon指數(shù)值均高于伐林栽參模式，農(nóng)田栽參模式下這3種指數(shù)均最低，表明栽培模式能顯著影響人參根部內(nèi)生菌的形成和多樣性。許姍姍等（2019）通過高通量測序方法研究云南昭通蘋果栽培模式與根際土壤微生物菌群的關系，結果表明不同栽培模式影響根際土壤微生物種群，從而影響蘋果的生長。張紅霞等（2019）采集山藥連作2年的植株根際土壤及根莖，采用高通量測序技術研究根際土壤細菌多樣性，結果表明山藥根際土壤細菌優(yōu)勢群落為變形菌、綠彎菌、酸桿菌和放線菌。【本研究切入點】高通量測序技術可產(chǎn)生測序覆蓋度更高的基因數(shù)據(jù)，在細菌群落組成研究中能真實地反映環(huán)境中細菌群落的豐度和多樣性。目前，針對不同種植方法下淮山藥根際土壤細菌多樣性的高通量測序分析研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】基于Illumina HiSeq測序平臺，采用雙末端測序（Paired-End）的方法，對淮山藥根際土壤細菌的16S rDNA序列V4高變區(qū)進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行高通量測序，分析淮山藥袋料種植與常規(guī)定向種植方法下淮山藥根際土壤細菌群落多樣性和分布規(guī)律，了解2種不同種植方法下淮山藥根際土壤細菌群落的結構、物種組成及差異，探究根際土壤細菌與淮山藥的相互關系，為利用微生物多樣性指導淮山藥袋料種植提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為桂淮2號淮山藥。

1. 2 淮山藥種植

1. 2. 1 淮山藥定向種植 起壟后在距壟斜面15 cm左右深處鋪設塑料薄膜或其他硬質(zhì)材料，其斜度與水平面成35°左右，在硬質(zhì)材料上覆土3 cm左右后播種淮山藥種薯，淮山藥結薯時塊莖將順著硬質(zhì)材料定向伸長生長。

1. 2. 2 淮山藥袋料種植 先在土壤上開出一條深20～30 cm，長1.0～1.2 m、坡度10～15°的種植槽，種植槽內(nèi)鋪設經(jīng)裁制好的塑料膜，并用圓形木條或鐵管壓緊，然后填滿細松土并在膜內(nèi)施入肥料，混合形成袋料，最后將塑料膜交疊呈袋狀，頭部的塑料膜上種植種薯，種薯上覆蓋土壤6～8 cm。

1. 3 土壤樣品采集

于收獲期（2018年4月15日）從廣西南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)大滕村采集淮山藥根際土壤。采自淮山藥定向種植的土壤樣品標記為CK3，采自淮山藥袋料種植的土壤樣品標記為A3，2種栽培方式的田間管理一致。采集20 cm深的根際土壤，每個小區(qū)隨機選取5個點的土壤混合成1個樣品置于50 mL的無菌管中，并迅速放在液氮中運回實驗室。土壤樣品過2 mm篩，去除淮山藥土壤樣品中的雜物后分為2份，一份凍存于-80 ℃冰箱，用于高通量測序進行土壤微生物分析;另一份用于土壤pH和有機質(zhì)含量測定。

1. 4 土壤樣品pH和有機質(zhì)含量測定

采用電極電位法測定土壤樣品pH，用水合熱重鉻酸鉀氧化—比色法測定土壤樣品有機質(zhì)含量（鮑士旦，2000）。

1. 5 土壤樣品細菌16S rDNA擴增子V4高變區(qū)測序及多樣性分析

提取土壤的總DNA，針對細菌16S rDNA擴增子序列V4區(qū)域，利用Illumina HiSeq測序平臺進行雙末端測序。通過對Reads拼接過濾、操作分類單元（OTUs）聚類、物種注釋和豐度進行分析，根據(jù)物種注釋結果，選擇每個土壤樣品在不同分類水平上豐度排名靠前的物種繪制相對豐度柱形圖;再對OTUs進行Alpha多樣性指數(shù)等的統(tǒng)計和分析。樣品測序服務委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結果與分析

2. 1 土壤樣品pH和有機質(zhì)含量測定結果

2種淮山藥種植方法土壤樣品的測定結果顯示，CK3的pH為6.21，有機質(zhì)含量為32.2 g/kg;A3的pH為5.98，有機質(zhì)含量為30.0 g/kg。經(jīng)方差檢驗分析，2種種植方法的土壤樣品pH存在顯著差異（P<0.05，下同），而有機質(zhì)含量差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 2 土壤樣品細菌種群多樣性分析結果

2. 2. 1 OTU分析結果 對所有樣品的有效數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共獲得5203個OTUs，其中，CK3包含4717個OTUs，A3包含4557個OTUs。為分析不同樣品間共有和特有的OTUs，將所有樣品進行均一化處理后繪制韋恩圖（圖1）。圖1顯示，CK3和A3有4071個共有OTUs，CK3和A3特有的OTUs分別為646和486個，表明淮山藥定向種植的土壤細菌多樣性高于袋料種植。

2. 2. 2 淮山藥根際土壤細菌多樣性分析結果 Chao1指數(shù)表示細菌群落的豐富度，其值越高表示細菌群落物種的豐富度越高，細菌數(shù)量越多。圖2顯示2個樣品的細菌群落豐富度均隨著測序深度的增加而增加并逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量足夠反映出土壤樣品中的物種組成特征。Shannon指數(shù)表示樣品的細菌多樣性程度，指數(shù)越高表示細菌群落的物種多樣性越高，分布也越均勻。圖3顯示，當2個樣品的Shannon指數(shù)曲線最終趨于平緩時，定向種植的土壤細菌多樣性程度高于袋料種植。

2. 2. 3 在門水平上的細菌群落豐度分析結果 在門水平上，CK3共獲得41個類群，A3共獲得36個類群。其中，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Aci-dobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）為主要優(yōu)勢類群，5個優(yōu)勢類群在CK3和A3中的相對豐度分別為40.90%和40.77%、14.40%和16.36%、14.84%和12.93%、9.08%和9.45%、3.88%和4.52%，CK3和A3的土壤樣品中5個優(yōu)勢細菌門的相對豐度之和分別占土壤樣品細菌總豐度的83.10%和84.03%。圖4為門水平下相對豐度水平位于前10的細菌群落。

將門水平上平均相對豐度<1%的類群歸類為其他，CK3共獲得10個類群，A3共獲得11個類群。經(jīng)方差檢驗分析，2種種植方法的根際土壤樣品細菌群落在門水平上各類群平均相對豐度差異不顯著。

2. 2. 4 在綱水平上的細菌群落豐度分析結果 在綱水平上，CK3獲得98個類群，A3獲得91個類群，二者合計共100個類群。其中，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、放 線 菌 綱（unidentified-Actinobacteria）和δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）等5個細菌綱為主要優(yōu)勢類群，這5個優(yōu)勢類群在CK3和A3中的相對豐度分別為15.99%和16.84%、11.10%和9.99%、9.33%和9.50%、9.71%和8.15%、4.42%和4.38%，CK3和A3的土壤樣品中5個優(yōu)勢細菌綱的相對豐度之和分別占土壤樣品細菌總豐度的50.55%和48.86%。圖5為綱水平下相對豐度水平位于前20的細菌群落。

將綱水平上平均相對豐度<1%的類群歸類為其他，CK3共獲得21個類群，A3共獲得22個類群。經(jīng)方差檢驗分析，2種種植方法的根際土壤樣品細菌群落在綱水平上各類群平均相對豐度差異不顯著。

2. 2. 5 在目水平上的細菌群落豐度分析結果 在目水平上，CK3共獲得144個類群，A3共獲得134個類群，二者合計共147個類群。其中，黃單胞菌目（Xanthomonadales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和芽單胞菌目（Gemmatimonadales）等5個細菌目的相對豐度較高，5個細菌目在CK3和A3的相對豐度分別為8.80%和8.27%、6.26%和6.68%、5.46%和5.85%、4.48%和4.00%、3.78%和4.38%，CK3和A3的土壤樣品中5個細菌目的相對豐度之和分別占土壤樣品細菌總豐度的28.78%和29.18%。圖6為在目水平下相對豐度水平位于前30的細菌群落。

2. 2. 6 在科水平上的細菌群落豐度分析結果 在科水平上，CK3獲得282個類群，A3獲得265個類群，二者合計共292個類群。其中，黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、酸桿菌科（Acidobacteriaceae）、Solibacteraceae、小單孢菌科（Micromonosporaceae）和鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）等6個細菌科的相對豐度較高，6個細菌科在CK3和A3的相對豐度分別為6.08%和5.29%、3.78%和4.38%、3.65%和4.19%、2.92%和4.43%、3.37%和3.10%、3.01%和3.11%，CK3和A3的土壤樣品中6個細菌科的相對豐度之和分別占土壤樣品細菌總豐度的22.81%和24.50%。圖7為在科水平下相對豐度水平位于前30的細菌群落。

2. 2. 7 在屬水平上的細菌群落豐度分析結果 在屬水平上，CK3獲得500個類群，A3獲得449個類群，二者合計共530個類群。其中，水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、熱酸菌屬（Acidothermus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Bryobacter、Candidatus solibacter、Burkholderia-Paraburkholderia、Haliangium、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和Rhizomicrobium等10個細菌屬的相對豐度較高，10個細菌屬在CK3和A3的相對豐度分別為3.65%和3.66%、2.61%和2.95%、2.10%和2.03%、1.80%和2.26%、1.42%和2.16%、1.30%和2.01%、1.58%和1.40%、1.33%和1.58%、1.50%和1.38%、0.95%和1.37%，CK3和A3的土壤樣品中10個細菌屬的相對豐度之和分別占土壤樣品細菌總豐度的18.24%和20.80%。圖8為在屬水平下相對豐度水平位于前30的細菌群落。

3 討論

本研究采用高通量測序?qū)瓷剿幎ㄏ蚍N植和袋料種植方法的根際土壤細菌多樣性及其分布規(guī)律進行研究，分析2種不同種植方法淮山藥根際土壤細菌在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的優(yōu)勢類群，研究共檢測出包含變形菌門、酸桿菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌門在內(nèi)的41門細菌，其中變形菌門的相對豐度最高，該結果與Constancias等（2015）、Docherty等（2015）的研究結果一致;也與康捷等（2019）對麻山藥不同生長時期根際土壤微生物多樣性的研究結果一致。本研究中，定向種植方法土壤樣品的變形菌門相對豐度為40.90%，稍高于袋料種植的40.77%，但定向種植中的酸桿菌門相對豐度（14.40%）低于袋料種植（16.36%）。逄好勝（2016）研究認為，變形菌門屬于嗜營養(yǎng)菌，能在含碳量高的環(huán)境中快速生長，而酸桿菌門是貧營養(yǎng)菌，其數(shù)量受土壤酸堿度的影響，與土壤有機碳含量呈反比。本研究定向種植土壤樣品的pH為6.21，有機質(zhì)含量為32.2 g/kg，而袋料種植土壤樣品的pH為5.98，有機質(zhì)含量為30.0 g/kg，說明定向種植的土壤有機質(zhì)含量稍高，變形菌門的相對豐度也稍高，而袋料種植的土壤有機質(zhì)含量和pH稍低，因此酸桿菌門的相對豐度稍高，該結果與逄好勝（2016）的研究結果相吻合。

本研究共檢測出包含α-變形菌綱和γ-變形菌綱等優(yōu)勢菌綱在內(nèi)的100綱;黃單胞菌目和紅螺菌目等優(yōu)勢菌目在內(nèi)的147目，黃單胞菌科和芽單胞菌科等優(yōu)勢菌科在內(nèi)的292科，水恒桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等優(yōu)勢菌屬在內(nèi)的530屬。在屬水平上相對豐度最高的水恒桿菌屬隸屬于變形菌門伽馬變形菌綱黃單胞菌目，2014年鑒定命名，此屬已鑒定1種，屬名中的水恒指的是日本國山梨縣水恒湖，菌名中或可加上“湖”（萬云洋等，2017），但未查閱到Rhizomicro-bium相關特性的報道。在門和綱分類水平上，2種種植方法土壤樣品細菌群落各優(yōu)勢類群的相對豐度差異不顯著，表明2種不同種植方法土壤中細菌的優(yōu)勢類群相似，但整體上看，定向種植的根際土壤細菌群落多樣性高于袋料種植。

4 結論

與常規(guī)定向種植相比，袋料種植方法的淮山藥根際土壤有機質(zhì)和pH略低，在門和綱分類水平上，2種種植方法土壤樣品細菌群落各優(yōu)勢類群的相對豐度差異不顯著，細菌的優(yōu)勢類群相似。實際應用中可選擇合適的土壤進行袋料種植，并施用有機肥料，從而促進淮山藥的生長。因此，淮山藥袋料種植方法可行，可在旱坡地和石山地等非耕地應用，以拓寬淮山藥的種植用地范圍，不與主要糧食作物搶占耕地，豐富淮山藥栽培方法。

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（責任編輯 麻小燕）